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真核生物リボソームの品質管理における基質認識機構の解明

阐明真核核糖体质量控制中的底物识别机制

基本信息

批准号：
19K06487
负责人：
北畠真
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06487/
关键词：
リボソーム品質管理ユビキチン RNA

项目摘要

昨年度までにPlg1遺伝子のさまざまな位置にUAGコドンを挿入し、また、Plg1のC末端にHis6タグを挿入したバリアントを用意することができており、本年度はこれを酵母で発現させながら、BpaRSとサプレッサーtRNAの共発現を利用してUAGコドンへのBpa挿入を確認していく実験を行った。これら一連のセットにおいて、量の多い少ないはあるもののBpaを含むPlg1の発現がanti-His6抗体によるウエスタンブロッティングで確認されたが、残念ながらUV照射によるクロスリンク産物を明確に同定するには至らなかった。バリアントによってはクロスリンク産物のバンドがウエスタンブロットで確認できる場合があったが、再現性が低く、大量培養により質量分析を行うまでには到達していない。考えられるひとつの理由はPlg1のC末に識別用のHis6を融合していることである。Bpaによるサプレッションが起こった全長のPlg1だけを回収するため、C末端にHis6タグがどうしても必要である。しかしこのPlg1は、すでにそのC末端をリボソームに未着させて結合することがcryo-EMにより分かっており、C末端へのHis6タグの融合がその機能に大きな影響を与えることは自明であった。実験の必要からそのような融合を行ったが、これが安定的にPlg1がリボソームに結合することを阻害していたかもしれない。その反省から、Plg1のあまり保存されてない領域をランダムに選んでHis6に置換するスクリーニングを行い、機能に影響のない置換体の作出に成功したところである。ひきつづきこちらをベースにしてさまざまなBpa挿入を作り、目的を達成したい。

Last year, the UAG terminal was inserted into the C-terminal of Plg1, and His6 terminal was inserted into the C-terminal of Plg1. This year, the yeast was discovered, and the BpaRS terminal was used to detect the Bpa terminal. The number of Bpa in a series of cases including Plg1 and the detection of anti-His6 antibodies were determined by UV irradiation. The quality of the product is determined by the following conditions: low reproducibility, high volume culture, and quality analysis. The reason for this is that Plg1 and C end are used to identify His6 and merge them. Bpa, C, His6, C, D, C, C, D, D, C-terminal of Plg1, C- It is necessary to integrate and stabilize Plg1 and Plg 2. The results of the study show that the P1 gene is a new gene that can be used to detect the gene expression of the gene. The purpose of the project is to achieve the goal of the project.