真核生物リボソームの品質管理における基質認識機構の解明

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昨年度までにPlg1遺伝子のさまざまな位置にUAGコドンを挿入し、また、Plg1のC末端にHis6タグを挿入したバリアントを用意することができており、本年度はこれを酵母で発現させながら、BpaRSとサプレッサーtRNAの共発現を利用してUAGコドンへのBpa挿入を確認していく実験を行った。これら一連のセットにおいて、量の多い少ないはあるもののBpaを含むPlg1の発現がanti-His6抗体によるウエスタンブロッティングで確認されたが、残念ながらUV照射によるクロスリンク産物を明確に同定するには至らなかった。バリアントによってはクロスリンク産物のバンドがウエスタンブロットで確認できる場合があったが、再現性が低く、大量培養により質量分析を行うまでには到達していない。考えられるひとつの理由はPlg1のC末に識別用のHis6を融合していることである。Bpaによるサプレッションが起こった全長のPlg1だけを回収するため、C末端にHis6タグがどうしても必要である。しかしこのPlg1は、すでにそのC末端をリボソームに未着させて結合することがcryo-EMにより分かっており、C末端へのHis6タグの融合がその機能に大きな影響を与えることは自明であった。実験の必要からそのような融合を行ったが、これが安定的にPlg1がリボソームに結合することを阻害していたかもしれない。その反省から、Plg1のあまり保存されてない領域をランダムに選んでHis6に置換するスクリーニングを行い、機能に影響のない置換体の作出に成功したところである。ひきつづきこちらをベースにしてさまざまなBpa挿入を作り、目的を達成したい。