Analysis of mechanisms of mutations from DNA damage using genome editing and site-specifically modified plasmids

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DNA損傷を持ったままDNAポリメラーゼδとεがDNA複製を開始すると、DNA鎖の伸長が損傷部位で停止し、細胞死となる。しかし多くの生物の細胞では、損傷乗り越えDNA複製（TLS）とよばれる機構により、DNA複製を進めることができる。しかしTLSにはたらくDNAポリメラーゼ（Polη、κ、ιなど）の忠実度は低く、複製の際に突然変異を生じさせる。DNA損傷の種類によってはたらくTLSポリメラーゼの種類は異なるが、損傷の種類とはたらくTLSポリメラーゼの関係は明らかでない。我々はCRISPR/Cas9法によってヌクレオチド除去修復を欠損するヒトの色素性乾皮症（XP）細胞を用いてTLSポリメラーゼを欠損した細胞（ΔPolη、Δκ/PIP、ΔPolι）を作製した。これまで、これらの細胞に３ーアミノベンズアントロン（ABA：NBAの代謝活性体）、紫外線（UV）、シスプラチン（CisPt）を処理後、ΔPolηXP細胞がこれらに対し他の細胞より高感受性となることを明らかにした。また、NBA付加体をLacZ遺伝子中のグアニンに１分子もつSupFシャトルベクターを作製して、TLSが細胞中で起こると大腸菌コロニーの色が付くシャトルベクター系を開発した。これを用いて、PolηがNBA付加体の突然変異生成に寄与していることが示唆された。さらに、dG-C8-N2-ABAが最もシャトルベクターの複製率を低下させた。dG-C8-N2-ABAには主にPolηがError-free TLSに関与することがわかった。シスプラチン（CisPt）付加体をLacZ遺伝子に１分子だけもつシャトルベクタープラスミドを完成させた。