哺乳類におけるCRISPR-Cas様ウイルス防御機構の解析

哺乳动物类CRISPR-Cas病毒防御机制分析

• 批准号: 21K15457
• 负责人: 小出 りえ
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15457/
• 关键词: 内在性RNAウイルス; 抗ウイルス免疫; 哺乳類; PIWI-interacting RNA; CRISPR-Cas

1. PIWI-piRNA経路ノックアウトがBoDV感染に及ぼす影響RNA切断活性に重要とされるPIWIドメインの一部を欠損したMili conditional KO（Mili cKO）マウスのコロニーを樹立し、これらのマウスの海馬から作製した神経前駆細胞（NPC）を用いてsmall RNA-seqを行った。その結果、Mili cKOマウスと野生型マウスのNPCにおいて、リード数やシーケンス長、シーケンスバイアスの差は殆ど認められず、NPCにおけるpiRNAの発現も精巣と比較すると非常に低かった。そこでBoDV感染に対するPIWI-piRNA経路の影響をより正確に評価できるin vitro実験系として、精子幹細胞を用いた新たな実験系を検討した。現在、野生型およびMili KOマウス由来の精子幹細胞を用いてBoDVの感染実験を進めている。2. EBLN由来piRNAによる抗ウイルス機構の解析先行研究からEBLN由来piRNAがNPCにおいてBoDVのmRNAをサイレンシングする可能性を着想したが、small RNA-seq解析の結果、NPCにおけるEBLN由来piRNAの発現は確認できなかった。一方、精巣由来の小分子RNAは、piRNAの特徴である1Uバイアスを示し、piRNAクラスターの内部もしくは近傍に存在するEBLN3, 4, 5全てにマップされた。また、BoDV N遺伝子の配列をpiRNAクラスターにノックインしたBoDV-N KIマウスの精巣において、小分子RNAがpiRNAクラスター内のBoDV-N配列にマップされることを確認した。

1。Piwi-PiRNA途径敲除对MILI条件KO（MILI CKO）小鼠的BODV感染菌落的影响，在PIWI结构域的一部分中缺乏PIWI结构域（认为对RNA裂解活性很重要），并使用神经祖细胞（NPCS）生产的himpcampus himpcampus himpAccAmpAmp，这对RNA裂解活性很重要，并且使用神经祖细胞（NPCS）进行了小的RNA-Seq。结果，与睾丸相比，NPC的读数计数，序列长度或序列偏置和野生型小鼠的NPC偏差也很低。因此，我们使用精子细胞作为体外实验系统研究了一种新的实验系统，该系统可以更准确地评估Piwi-PiRNA途径对BODV感染的影响。目前，正在使用源自野生型和Mili KO小鼠的精子干细胞进行实验以用BODV感染。 2。通过EBLN衍生的PIRNA对抗病毒机制进行分析，先前的研究已经想到了EBLN衍生的PIRNA可能会使NPC中的BODV mRNA沉默，但是小的RNA-SEQ分析表明，未确认NPC中EBLN衍生的PIRNA的表达。另一方面，睾丸中的小分子RNA表现出1U的偏置特征，并映射到PIRNA簇内或附近存在于或附近的所有EBLN3、4和5。此外，在BODV-N KI小鼠的睾丸中，将小分子RNA映射到Pirna簇内的BODV-N序列，其中将BODV-N基因的序列敲入PIRNA簇中。

项目成果

The regulation of persistent Borna disease virus infection by RNA silencing factors in human cells

人体细胞中RNA沉默因子对博尔纳病病毒持续感染的调节

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2023.03.069
• 发表时间: 2023
• 期刊: Biochemical and Biophysical Research Communications
• 影响因子: 3.1
• 作者: Kaneko Yuka;Naito Yuui;Koide Rie;Parrish Nicholas F.;Takahashi Tomoko
• 通讯作者: Takahashi Tomoko