血液型D抗原の相互作用分子との分子間ネットワークとスプライシング機構の解明

阐明 D 型血抗原的分子间网络与相互作用分子和剪接机制

• 批准号: 21K16249
• 负责人: 三島 由祐子
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Kyorin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16249/
• 关键词: RhD; 発現制御メカニズム

D抗原の発現は赤血球の形態維持に関与しており、D抗原関連分子群が正常に働かなくなると赤血球は正常な形態を保てなくなる。これまでに、D抗原の発現制御に重要なのは、Rhファミリー分子およびその他の相互作用分子との膜蛋白複合体形成と、スプライシング制御であることが判明している。本研究はRhD抗原の発現制御メカニズムをこれら相互作用分子とスプライシング制御機構に着目して検討、その分子間ネットワークを明らかにすることを目的とする。まず、相互作用分子の機能解析を目的に、RhDの既知の相互作用分子、候補分子について蛋白・蛋白間相互作用が具体的にどの蛋白間で起きているのか検討した。これまでにAnkyrin1, RhAGは直接相互作用するキー分子ではないことがわかった。次にRhDの各アイソフォームを組み込んだN末端GFP, Myc, HA, Flag-tag付の強制発現ベクターと、相互作用分子とし球状赤血球症原因遺伝子として知られるspectrinA, spectrinB, band3を選択し、これらに GFP, Myc, HA, Flag-tagを付けた全長・各機能ドメイン の強制発現ベクターを様々な組み合わせで293細胞へ同時導入、免疫沈降を行った。その結果spectrinA, spectrinBの相互作用候補分子ではRhD蛋白との特異的な共沈を認めなかった。band3は抗GFP抗体結合アガロースゲルで免疫沈降したのち抗Myc抗体で検出することができたため、band3はRhDに直接結合していることがわかった。これを確認するためにCheckMate system を用いてBand3と全長RhDの細胞内での結合をluciferase reporter assayで確認、ついでRhDの蛋白を短くして結合部位の確認を実施している。

The appearance of D antigen is related to the maintenance of the morphology of red blood cells, the group of D antigen-related molecules is normal, and the morphology of red blood cells is normal. The development of D antigen is important for the formation of membrane protein complexes and for the regulation of D antigen. This study aims to investigate the molecular interaction mechanism of RhD antigen in the production and control of RhD antigen. The function analysis of interacting molecules is aimed at the interaction of RhD with known interacting molecules and candidate molecules. The interaction between proteins is discussed in detail. Ankyrin1, RhAG directly interacts with each other. N-terminal GFP, Myc, HA, Flag-tag stress detection, interaction molecules, spectrinA, spectrinB, band3, full length GFP, Myc, HA, Flag-tag stress detection, simultaneous introduction of 293 cells, immune sedimentation. The results of spectrinA, spectrinB interaction candidate molecules are RhD protein specific co-precipitation. Band3: Anti-GFP antibody binds to anti-Myc antibody directly. The CheckMate system is used to determine the intracellular binding of Band3 and full-length RhD. The luciferase reporter assay is used to determine the binding site of the RhD protein.