凍結破砕技術を利用した個体組織におけるタンパク質―DNA間相互作用解析系の開発

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研究目的:グルココルチコイド(GC)応答性遺伝子発現の中核を担う転写因子、GCレセプター(GR)は全身に発現しており、その遺伝子発現制御機構の解明は、生物学的・医学的に重要な課題である。本研究では、動物生体組織を対象としたクロマチン免疫沈降法(ChIPアッセイ)を確立する事を目的とし、モデルとしてマウス・ラット骨格筋におけるGC応答性遺伝子を標的として用いる。研究方法:凍結破砕技術による組織の細断化が、個体組織中のタンパク質、DNA、RNAを革新的に高効率で抽出した事に着目し、凍結破砕条件、GR-標的DNAの溶液中への抽出とその断片化の為に行うソニケーション条件、各々の最適化を試みた。これら各条件の評価は、培養筋芽細胞系を用いたChIPアッセイの結果との対比により行った。研究成果:培養筋芽細胞系において、GC応答遺伝子(MuRF1,atrogin-1,FKBP5,REDD1)のプロモーター領域内に、GRがデキサメタゾン(DEX)依存的に結合する位置を既に同定している。ゲノムDNAと転写因子を化学的にクロスリンクする際、解剖後の生組織をそのまま、あるいは勇刀にて約1mm立方に裁断した状態で行った場合、GRと共沈するDNA断片の収量が一定しなかった。一方、生組織を液体窒素中で凍結した後に、圧縮空気駆動のステンレス製圧砕機にて、約0.1mm立方に凍結破砕した上で行った場合、動物腓腹筋、ヒラメ筋におけるGC応答遺伝子プロモーター上へのDEX依存的なGRリクルートメントを再現性良く検出できた。この時、対象組織の重量に応じて凍結破砕のプレス時間を実証的に検討・調節する事が再現性に重要であった。生組織の凍結破砕技術は、ChIPアッセイに供する試料の調製において、極めて有用である事が示された。