低分子量G蛋白質PhoとProtein kinase Nの複合体の立体構造解析

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本研究の目的は真核生物の細胞内シグナル伝達を担い、様々な細胞機能を制御している低分子量G蛋白質スーパーファミリーに属するPhoとその標的蛋白質であるPKNとの相互作用を立体構造的に明らかにすることである。具体的にはPKNのPho結合ドメインとPhoの構造とそれらの複合体の溶液中での立体構造を、多重共鳴多次元NMRにより原子レベルで決定する。Phoはアクトミオシン系を介して細胞形態の維持や細胞運動、細胞質分裂、平滑筋の収縮などを制御すると考えられている。Pho蛋白質についてはC末端の脂質結合部位を除く181残基に対応する部分を大腸菌に発現させ、大量調整することにより1次元^1H-NMRスペクトル、2次元^1H-^<15>N HSQCスペクトルの測定を行い蛋白質が安定な立体構造を保持することを示した。また1次元^<31>P-NMRスペクトルの測定による結合したヌクレオシドの同定を行った。Protein kinase NのPho結合ドメインの大腸菌による発現と精製を試みたが大腸菌由来のプロテアーゼによる消化を受けやすく、大量かつ安定な試料調整が極めて困難であった。PhoキナーゼのPho結合ドメインは大腸菌から大量に調整することが出来、2次元^1H-^<15>N HSQCスペクトル測定を行った。その結果、単独では溶液中でランダムな構造を取っていることが推察された。しかしPhoとの結合により立体構造変化を起こすことが示唆されるデータが得られた。