組換えの際に生じるDNA構造と蛋白質による識別

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本研究の目的はDNAの構造研究という立場から、組換えに必要なDNAの構造上の条件をつめ、さらに組換えに関与する蛋白質によって、どのようにその構造が誘起、識別されるかを明らかにし、組換えの構造化学的な説明を行うことにある。具体的には組換えの中間に生じると言われるHolliday構造を合成DNAで作らせ、その構造をとる条件、その立体構造を明らかにすること、さらにRuvC蛋白質との結合様式の解明を期す。Holliday構造の探索:4本の非等価で、半分ずつ相補的な塩基配列を持つ合成DNAをDNA合成機で作り、加熱徐冷して十字型のHolliday構造をとらせた。後の構造解析に便利な種々の塩基配列を持ち、種々の長さのものを合成して、室温で安定なHolliday構造を形成させた。UV、CD、電気泳動等でその形成を検証した。さらに金属、特にマグネシウムがHolliday構造の安定化に寄与していることがわかった。Holliday構造の立体構造:未だHollidayジャンクションの立体構造は明らかでないので、核磁気共鳴によって立体構造の解析を始めた。しかしNMRでも残基数が30以上になるとまともな方法では解析できない。中央の数残基のみ^<13>C、^<15>N等の安定同位体で標識したDNAを合成し、特に中央部の交叉構造部位のみの構造を調べることを試みた。RuvCによる認識:RuvCはHolliday構造に結合し、homologousな配列があれば切断する。ゲルシフトの実験からhomologousであろうがなかろうがHolliday構造をとるとRuvCは結合できることがわかった。Footprintの実験から中央約12塩基対がRuvCでおおわれることがわかった。また、中央にどのくらいhomologousな配列があればRuvCが切断するか検討したら、中央の4塩基対(各アーム1塩基対)でよいこともわかった。