ネコカリシウィルス非構造蛋白の同定とその機能の解析

猫杯状病毒非结构蛋白的鉴定及其功能分析

• 批准号: 09760274
• 负责人: 遠矢 幸伸
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760274/
• 关键词: ネコカリシウィルス; 非構造蛋白; RNA; 組み換え発現; プロテアーゼ; RNAポリメラーゼ; ネコカリシウイルス

本研究の目的はネコカリシウイルス(FCV)の各非構造蛋白の分子量と遺伝子領域を同定し、それらの機能を解析することにある。本年度は、主に以下の4項目について研究を行い、いくつかの新たな知見を得た。1. カプシド蛋白前駆体をtransに切断するプロテアーゼ遺伝子領域の決定:ORF1の全体、5'側2080塩基、3CD並びに3Cの各領域を発現ベクターに組み込んだ。各発現ベクターとORF2発現ベクターとをCOS細胞へ同時導入し、カプシド蛋白前駆体の切断をイムノプロットで検討したところ、3C領域発現産物に切断活性が認められ、本領域がFCVのプロテアーゼ遺伝子であることが示された。2. ORF1発現産物のN末端側蛋白の同定:ORFlの5'側の領域(2A)がコードする蛋白を大腸菌で融合蛋白として発現させ、マウスに免疫して抗2A特異免疫血清を作製した。本抗血清を用いたイムノブロットによりFCV感染細胞内での発現蛋白の解析を行ったところ、分子量35,000の蛋白(35K蛋白)が検出された。さらに、FCV感染細胞に45℃処理を行うと35K蛋白に加え、その前駆体と考えられる65K、80K、120K及び200K蛋白が検出され、ORF1の発現産物である200Kのポリ蛋白が種々の解裂を経て各種非構造蛋白となることが示唆されるとともに、ORF1発現産物のN末端側蛋白は35K蛋白であることが示された。3. RNAポリメラーゼ遺伝子の比較解析:呼吸器または腸管由来FCV9株のRNAポリメラーゼ遺伝子をPCR法で増幅し塩基配列を決定、比較したが、ウイルス分離部位と分子遺伝学的な特徴との関連は認められなかった。4. 感染性クローンの構築:各種フルゲノムサイズのcDNAを構築し、試験管内転写反応によりRNAを合成して培養細胞に導入を条件を変化させながら行ったが、感染性ウイルスの産生は認められなかった。

The purpose of this study was to identify molecular weights and molecular domains of non-structural proteins in FCV and to analyze their functions. This year, the following four projects were carried out. 1. The determination of ORF1, ORF 5, ORF 3, ORF 4, ORF 5, ORF 6, ORF 7, ORF 8, ORF 9, ORF 9, ORF 9 Each of the three discovery sequences, ORF2 discovery sequence and COS cell, was simultaneously introduced into COS cells. The cleavage sequence of the protein precursor was discussed in detail. The cleavage activity of the 3C domain discovery product was recognized. The field was the first to introduce the FCV protein precursor sequence. 2. Identification of the N-terminal protein of the ORF1 discovery product: The protein in the 5'domain (2A) of ORF1 was discovered as a fusion protein in Escherichia coli and used for immunization. Anti-2A-specific immune serum was prepared. This antiserum was used to analyze the protein expressed in FCV infected cells. The protein with molecular weight of 35,000 (35K protein) was detected. In addition, FCV-infected cells were treated at 45℃ for 35K protein addition, precursor and detection of 65K, 80K, 120K and 200K proteins. ORF1 protein production products were detected at 200K protein cleavage and detection of various non-structural proteins. ORF1 protein production products were detected at 35K protein. 3. Comparative analysis of the RNA Polimera-gene: The RNA Polimera-gene of the FCV9 strain derived from the respiratory tract was amplified by PCR to determine and compare the nucleotide sequences. The characteristics and relationships between the isolation site of the RNA Polimera-gene and molecular genetics are clearly recognized. 4. Construction of infectious cells: construction of cDNA for various types of infectious cells, synthesis of RNA in test tubes, introduction of conditions for production of infectious cells

项目成果

M.Hashimoto: "Genetic analysis of the RNA polymerase gene of calicivirus from days and cats" The journal of Vererinary Medical Science. 61巻(発表予定). (1999)

M. Hashimoto：“来自天和猫的杯状病毒的 RNA 聚合酶基因的遗传分析”《Vererinary Medical Science》杂志第 61 卷（待出版）。