ネコカリシウイルス非構造蛋白遺伝子の発現とプロセッシング機構の解析

本研究の目的は、ネコカリシウイルス(FCV)の各非構造蛋白の分子量と、それらをコードするOpen reading framel(ORF1)における遺伝子領域を主にORF1発現系を用いて同定し、非構造蛋白の機能とプロセッシング機構を解析することにある。FCV・F4株のORF1領域全てを含む遺伝子断片を、遺伝子配列をすでに明かにした2つのcDNAクローンから制限酵素により切り出し、SRαをプロモーターとする発現ベクターであるpME-18Sに組み込み、ORF1発現プラスミドpMCV-Iを構築した。pMCV-I単独で、またはカプシド蛋白発現プラスミドpMCV-IIと同時に培養細胞(COS-7)にトランスフェクトし、その発現蛋白をイムノブロット解析し、以下の成績を得た。1)pMCV-I単独でトランスフェクトした細胞中に、FCV・F4株感染猫血清を用いたイムノブロット解析ではORF1産物は検出されなかった。pMCV-IとpMCV-IIを同時にトランスフェクトした細胞中には、カプシド蛋白特異的モノクローナル抗体を用いたイムノブロット解析により、pMCV-II単独でトランスフェクトした場合には検出されないプロセッシングを受けた65キロダルトン(kd)のカプシド蛋白が76kdのカプシド蛋白前駆体とともに検出された。以上の成績から、FCVのカプシド蛋白のプロセッシングにおいて、FCVの非構造蛋白をコードするORF1産物がトランスに関与することが示され、FCVのウイルスプロテアーゼの存在が示唆された。また、pMCV-1産物をイムノブロットで直接検出するためには、FCV感染血清ではなく、別の発現系で得られた非構造蛋白に対する抗体が必要と考えられた。

本研究の目的は、ネコカリシウイルス(FCV)の各非構造蛋白の分子量と、それらをコードするOpen reading framel(ORF1)における遺伝子領域を主にORF1発現系を用いて同定し、非構造蛋白の機能とプロセッシング機構を解析することにある。FCV・F4株のORF1領域全てを含む遺伝子断片を、遺伝子配列をすでに明かにした2つのcDNAクローンから制限酵素により切り出し、SRαをプロモーターとする発現ベクターであるpME-18Sに組み込み、ORF1発現プラスミドpMCV-Iを構築した。pMCV-I単独で、またはカプシド蛋白発現プラスミドpMCV-IIと同時に培養細胞(COS-7)にトランスフェクトし、その発現蛋白をイムノブロット解析し、以下の成績を得た。1)pMCV-I単独でトランスフェクトした細胞中に、FCV・F4株感染猫血清を用いたイムノブロット解析ではORF1産物は検出されなかった。pMCV-IとpMCV-IIを同時にトランスフェクトした細胞中には、カプシド蛋白特異的モノクローナル抗体を用いたイムノブロット解析により、pMCV-II単独でトランスフェクトした場合には検出されないプロセッシングを受けた65キロダルトン(kd)のカプシド蛋白が76kdのカプシド蛋白前駆体とともに検出された。以上の成績から、FCVのカプシド蛋白のプロセッシングにおいて、FCVの非構造蛋白をコードするORF1産物がトランスに関与することが示され、FCVのウイルスプロテアーゼの存在が示唆された。また、pMCV-1産物をイムノブロットで直接検出するためには、FCV感染血清ではなく、別の発現系で得られた非構造蛋白に対する抗体が必要と考えられた。