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心筋細胞におけるチロシンキナーゼPyk2の遅延型整流Kチャネルの修飾

心肌细胞中酪氨酸激酶 Pyk2 延迟整流 K 通道的修饰

基本信息

批准号：
09770501
负责人：
小玉博明
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

心筋細胞においてAngiotensinII(AngII)、Endothelin-1(ET-1)によりPyk2が如何なる経路で活性化され、さらに電位依存性KチャネルKv1.2の機能調節に関与しているかを明らかにするため以下の実験を行った。ラット培養心筋細胞をAngII.ET-1により刺激した。対照としてBradykinin(1μM)、PMA(5μM)、A23187(10μM)、を使用した。(1)Pyk2を免疫沈降しチロシンリン酸化を観察した。(2)ET-1によるPyk2リン酸化に対する百日咳毒素(PTX)、chelerythrin(PKC阻害薬)、BAPTA-AM、cytochalasinD(Actin重合阻害剤)、AG1478(EGF受容体阻害薬)、radicicol(Src阻害薬)の抑制効果を観察した。(3)Kv1.2を免疫沈降しチロシンリン酸化を観察した。(4)共免疫沈降によりPyk2とKv1.2の結合を観察した。(5)Pyk2免疫沈降物によるGST-Kv1.2のリン酸化を観察した。その結果、(1)AngII、ET-1によりPyk2は30秒後よりリン酸化が認められ2分後に最大となった。Pyk2リン酸化はBradykinin.PMAで認められたが、KCl、A23187では認めなかった。(2)Pyk2リン酸化はPTX、AG1478、radicicolでは抑制されずchelerythrin、BAPTA-AM、cytochalasinDにより完全に抑制された。(3)Kv1.2リン酸化は刺激後30秒より増強し2分で最大となった。このリン酸化はcytochalasinDにより有意に抑制された。(4)Kv1.2とPyk2の会合は刺激後増強した。(5)in vitroでのPyk2によるKv1.2のリン酸化を確認した。以上より、心筋細胞においてAngII、ET-1の刺激によりGq、PKCを介し、caおよび細胞骨格依存性にPyk2が活性化された。また、活性化Pyk2はKv1.2と会合し、Kv1.2を直接リン酸化することが証明された。

In cardiac muscle cells, AngiotensinII(AngII) and Endothelin-1(ET-1) are involved in how Pyk2 is activated in the pathway, and in the functional regulation of potential-dependent Kv1.2. Cultured cardiac muscle cells are stimulated by AngII.ET-1 For example, Bradykinin(1μM), PMA(5μM), A23187(10μM), and A23187 were used. (1) Pyk2 is detected in immune system. (2) The inhibitory effects of PT, chelerythrin(PKC inhibitor), BAPTA-AM, cytochalasin D (Actin inhibitor), AG1478(EGF receptor inhibitor) and radicol (Src inhibitor) on ET-1 were investigated. (3)Kv1.2 immune response and immune response. (4)The binding of Pyk2 to Kv1.2 was detected by immunoprecipitation. (5) Pyk2 immuno-deposition and GST-Kv1.2-free acidification were observed. Results: (1)AngII, ET-1, Pyk2, 30 seconds later, Acidification, 2 minutes later, Maximum. Pyk2 is acidified Bradykinin.PMA, KCl, A23187 (2) Pyk2 acid PTX, AG1478, radicol completely inhibit chelerythrin, BAPTA-AM, cytochalasin D. (3)Kv1.2 Acidification 30 seconds after stimulation increased by 2 minutes to the maximum. This is the first time that we've seen this. (4)Kv1.2 and Pyk2 are stronger after convergence stimulation. (5)in Vitro's Pyk2 and Kv1.2 are confirmed. The above mentioned factors, such as AngII and ET-1 stimulation, Gq, PKC mediation, ca and cytoskeleton dependence, and Pyk2 activation, are also discussed. The activation of Pyk2 is proved by the direct acidification of Kv1.2.