ハブ毒中のアポトーシス誘導活性成分の同定及びその作用機序の解明

哈布毒液中诱导细胞凋亡活性成分的鉴定及其作用机制的阐明

基本信息

  • 批准号:
    11760079
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.28万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1999
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1999 至 2000
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

ハブ毒はタンパク質の宝庫であり,筋壊死,出血,浮腫等の多様な生理作用をもつ。筋壊死に関連してハブ毒中のアポトーシス誘導成分に注目した。ハブ粗毒に複数の成分にアポトーシス誘導活性が存在することを明らかとした。本研究では特に,活性に必須のCa^<2+>結合部位49位AspがLysに置換した低活性型ホスホリパーゼA_2アイソザイム([Lys^<49>]PLA_2)について報告する。1.[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性の解析[Lys^<49>]PLA_2は,HL-60細胞に対し濃度及び反応時間に依存的に作用し,アポトーシス小体,クロマチンの凝縮,核断片化を確認した。興味深いことに高酵素活性[Asp^<49>]PLA_2は細胞毒性を全く示さなかった。2.[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性と酵素活性の関係酵素活性とアポトーシス誘導の関係をより明確にするため,p-ブロモフェナシルブロミドで不活化した酵素を調整し,そのアポトーシス誘導の解析を行ったところ,[Lys^<49>]PLA_2と同程度のアポトーシス誘導を示した。[Lys^<49>]PLA_2によるアポトーシス誘導活性はその酵素活性とは独立したものであると結論した。3.[Lys^<49>]PLA_2アポトーシス誘導とカスパーゼ酵素系の関係アポトーシス実行過程に代表的な酵素群であるカスパーゼ3及び6の経路が[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性に関与しているか調べた。カスパーゼ阻害剤は[Lys^<49>]PLA_2のHL-60細胞死に阻害効果を示さなかった。またカスパーゼ3及び6の細胞内酵素活性もアポトーシス非誘導と何ら変化しなかった。さらにカスパーゼ酵素群の基質Poly(ADP-ribose)ploymeraseも分解されなかった。これらの結果より,[Lys^<49>]PLA_2のHL-60細胞に対するアポトーシス誘導はカスパーゼ3及び6に非依存的であると結論付けた。4.[Lys^<49>]PLA_2の細胞内作用機序について[Lys^<49>]PLA_2の細胞内作用部位を明らかとするため,それに特異的な抗体を作製し,共焦点レーザー顕微鏡で解析した。さらに細胞粗分画成分によるビアコア(生体物質相互作用解析装置)でも解析した結果,細胞膜に点々と局在して作用していることが明らかとなった。
Youdaoplaceholder0 poison タ タ パ パ the treasure house of the fibrous tissue であ, tendon 壊 death, hemorrhage, edema and other multiple な physiological effects を タ. The tendon 壊 death に is related to the <s:1> てハブ in the poison, the <s:1> アポト シス シス シス inducing components に attention た. Poison に plural の component on ハ ブ に ア ポ ト ー シ ス induction activity が exist す る こ と を Ming ら か と し た. This study で は に, active に must の Ca ^ 2 + < > combining site 49 Asp が Lys に replacement し た low activity type ホ ス ホ リ パ ー ゼ A_2 ア イ ソ ザ イ ム ([Lys ^ < > 49] PLA_2) に つ い て report す る. 1. [Lys ^ < > 49] PLA_2 の ア ポ ト ー シ ス induction activity の parse [Lys ^ < > 49] PLA_2 は, HL 60 cells に し concentration and seaborne び anti に 応 time dependent に し, ア ポ ト ー シ ス corpuscle, ク ロ マ チ ン の condensation, nuclear fragment the を confirm し た. Deep interest: <s:1> <s:1> とに high enzyme activity [Asp^<49>]PLA_2 <s:1> cytotoxicity を all く show さな った った. 2. [Lys ^ < > 49] PLA_2 の ア ポ ト ー シ ス induction activity と enzyme activity の masato is enzymatic activity と ア ポ ト ー シ ス induced の masato is を よ り clear に す る た め, p - ブ ロ モ フ ェ ナ シ ル ブ ロ ミ ド で inactive し た enzyme を adjust し, そ の ア ポ ト ー シ ス induced の parsing line を っ た と こ ろ, [Lys ^ 49 > < PLA_2と induces を to the same extent アポト シス シス シス to show アポト た. [Lys ^ < > 49] PLA_2 に よ る ア ポ ト ー シ ス induction activity は そ の enzyme activity と は independent し た も の で あ る と conclusion し た. 3. [Lys ^ < > 49] PLA_2 ア ポ ト ー シ ス induced と カ ス パ ー ゼ enzyme is の masato is ア ポ ト ー シ ス に representative be line process of な enzyme で あ る カ ス パ ー ゼ 3 and 6 の び 経 road が [Lys ^ < > 49] PLA_2 の ア ポ ト ー シ ス induction activity に masato and し て い る か adjustable べ た. The inhibitory effect of カスパ カスパ ゼ ゼ on the death of HL-60 cells を shows that さな った った った. ま た カ ス パ ー ゼ 3 and 6 の び intracellular enzyme activity も ア ポ ト ー シ ス not induced と ら variations change し な か っ た. さ ら に カ ス パ ー ゼ enzyme group of Poly real の matrix (ADP ribose) ploymerase も decomposition さ れ な か っ た. こ れ ら の results よ り, [Lys ^ < > 49] PLA_2 の - HL 60 cells に す seaborne る ア ポ ト ー シ ス induced は カ ス パ ー ゼ 3 and 6 に び not dependent で あ る と conclusion pay け た. 4. [Lys ^ < > 49] PLA_2 の cells within the machine sequence に つ い て [Lys ^ < > 49] PLA_2 の cells within the site を Ming ら か と す る た め, そ れ に し the specific antibody を な cropping systems, common focus レ ー ザ ー 顕 micromirror で parsing し た. さ ら に points draw component on cell に よ る ビ ア コ ア (raw) material interaction analysis device で も parsing し た as a result, the cell membrane に point 々 と bureau in し て role し て い る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

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Chijiwa T. et al.: "Regional evolution of venom-gland phospholipase A_2 isozymes of Trimeresurus flavoviridis snakes in the southern islands of Japan"Biochem,.J.. 491. 491-499 (2000)
Chijiwa T.等:“日本南部岛屿竹叶青蛇毒腺磷脂酶A_2同工酶的区域进化”Biochem,.J.. 491. 491-499 (2000)
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