ハブ毒中のアポトーシス誘導活性成分の同定及びその作用機序の解明

ハブ毒はタンパク質の宝庫であり,筋壊死,出血,浮腫等の多様な生理作用をもつ。筋壊死に関連してハブ毒中のアポトーシス誘導成分に注目した。ハブ粗毒に複数の成分にアポトーシス誘導活性が存在することを明らかとした。本研究では特に,活性に必須のCa^<2+>結合部位49位AspがLysに置換した低活性型ホスホリパーゼA_2アイソザイム([Lys^<49>]PLA_2)について報告する。1.[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性の解析[Lys^<49>]PLA_2は,HL-60細胞に対し濃度及び反応時間に依存的に作用し,アポトーシス小体,クロマチンの凝縮,核断片化を確認した。興味深いことに高酵素活性[Asp^<49>]PLA_2は細胞毒性を全く示さなかった。2.[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性と酵素活性の関係酵素活性とアポトーシス誘導の関係をより明確にするため,p-ブロモフェナシルブロミドで不活化した酵素を調整し,そのアポトーシス誘導の解析を行ったところ,[Lys^<49>]PLA_2と同程度のアポトーシス誘導を示した。[Lys^<49>]PLA_2によるアポトーシス誘導活性はその酵素活性とは独立したものであると結論した。3.[Lys^<49>]PLA_2アポトーシス誘導とカスパーゼ酵素系の関係アポトーシス実行過程に代表的な酵素群であるカスパーゼ3及び6の経路が[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性に関与しているか調べた。カスパーゼ阻害剤は[Lys^<49>]PLA_2のHL-60細胞死に阻害効果を示さなかった。またカスパーゼ3及び6の細胞内酵素活性もアポトーシス非誘導と何ら変化しなかった。さらにカスパーゼ酵素群の基質Poly(ADP-ribose)ploymeraseも分解されなかった。これらの結果より,[Lys^<49>]PLA_2のHL-60細胞に対するアポトーシス誘導はカスパーゼ3及び6に非依存的であると結論付けた。4.[Lys^<49>]PLA_2の細胞内作用機序について[Lys^<49>]PLA_2の細胞内作用部位を明らかとするため,それに特異的な抗体を作製し,共焦点レーザー顕微鏡で解析した。さらに細胞粗分画成分によるビアコア(生体物質相互作用解析装置)でも解析した結果,細胞膜に点々と局在して作用していることが明らかとなった。

ハブ毒はタンパク質の宝庫であり,筋壊死,出血,浮腫等の多様な生理作用をもつ。筋壊死に関連してハブ毒中のアポトーシス誘導成分に注目した。ハブ粗毒に複数の成分にアポトーシス誘導活性が存在することを明らかとした。本研究では特に,活性に必須のCa^<2+>結合部位49位AspがLysに置換した低活性型ホスホリパーゼA_2アイソザイム([Lys^<49>]PLA_2)について報告する。1.[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性の解析[Lys^<49>]PLA_2は,HL-60細胞に対し濃度及び反応時間に依存的に作用し,アポトーシス小体,クロマチンの凝縮,核断片化を確認した。興味深いことに高酵素活性[Asp^<49>]PLA_2は細胞毒性を全く示さなかった。2.[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性と酵素活性の関係酵素活性とアポトーシス誘導の関係をより明確にするため,p-ブロモフェナシルブロミドで不活化した酵素を調整し,そのアポトーシス誘導の解析を行ったところ,[Lys^<49>]PLA_2と同程度のアポトーシス誘導を示した。[Lys^<49>]PLA_2によるアポトーシス誘導活性はその酵素活性とは独立したものであると結論した。3.[Lys^<49>]PLA_2アポトーシス誘導とカスパーゼ酵素系の関係アポトーシス実行過程に代表的な酵素群であるカスパーゼ3及び6の経路が[Lys^<49>]PLA_2のアポトーシス誘導活性に関与しているか調べた。カスパーゼ阻害剤は[Lys^<49>]PLA_2のHL-60細胞死に阻害効果を示さなかった。またカスパーゼ3及び6の細胞内酵素活性もアポトーシス非誘導と何ら変化しなかった。さらにカスパーゼ酵素群の基質Poly(ADP-ribose)ploymeraseも分解されなかった。これらの結果より,[Lys^<49>]PLA_2のHL-60細胞に対するアポトーシス誘導はカスパーゼ3及び6に非依存的であると結論付けた。4.[Lys^<49>]PLA_2の細胞内作用機序について[Lys^<49>]PLA_2の細胞内作用部位を明らかとするため,それに特異的な抗体を作製し,共焦点レーザー顕微鏡で解析した。さらに細胞粗分画成分によるビアコア(生体物質相互作用解析装置)でも解析した結果,細胞膜に点々と局在して作用していることが明らかとなった。