乳脂肪分泌に関わる乳脂肪球皮膜タンパク質の細胞生物学・発生工学的解析

参与乳脂分泌的乳脂球外壳蛋白的细胞生物学和发育工程分析

基本信息

批准号：
11760223
负责人：
青木直人
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

マウスゲノムライブラリーのスクリーニングにより得たブチロフィリンの遺伝子断片を、ブチロフィリン遺伝子と相同組み換えを起こさせるために、ネオマイシン耐性遺伝子(ポジティブセレクション)と単純ヘルペスウィルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を含むターゲッティングベクターに組み込み、PCR法、DNAシークエンシングにより目的とするコンストラクトが構築されていることを確認した。得られたコンストラクトをエレクトロポレーション法により胚性幹細胞(ES細胞)に導入し、その後、ES細胞をG418およびgancyclovirを含むセレクション培地で培養し、薬剤耐性コロニーを得、サザンブロット解析、PCR法により相同組み換えが起きていることを確認した。セロトピン、ゴナドトロピン処理により過剰排卵を誘発したマウスより胚盤胞を摘出し、これに上記で得たブチロフィリン遺伝子を欠損したES細胞を、マイクロマニピュレーターで導入した。これを偽妊娠状態の仮親の子宮へ移植した。生まれたマウスの毛色より判断して出来るだけキメラ率の高い雄マウスを選別し、掛け合わせによりブチロフィリン遺伝子のヘテロ欠損マウスを得ようとしたが、再三の試みにも関わらずヘテロ欠損マウスを得ることは出来なかった。また、昨年度に引き続き、yeast two-hybridスクリーニングを継続し、ブチロフィリンの細胞内ドメインに結合するタンパク質を探索したが、新規分子の同定には至らなかった。しかしながら、昨年度明らかにした、ブチロフィリン上のxanthine oxidaseとの結合領域を3アミノ酸残基にまで絞り込むことに成功した。また、ブチロフィリン細胞内領域に存在するB30.2様ドメインがxanthine oxidaseとの結合に直接関与し、中でもヒト、マウス、ウシブチロフィリンすべてにおいて高度に保存されている3つのモチーフ構造が重要であることを様々なミュータントを用いた実験により明らかにした。

通过筛选小鼠基因组文库获得的丁香蛋白基因片段被掺入含有新霉素抗性基因的靶向载体中（阳性选择）和源自源自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因，并确认靶构建体是由PCR和DNA测序构建的。通过电穿孔将所得构建体引入胚胎干细胞（ES细胞）中，然后将ES细胞培养在含有G418和Gancyclovir的选择培养基中，以获得耐药菌落，并通过Southern Blot分析和PCR确认同源重组。从诱导5-促蛋白质和促性腺激素治疗的过度排卵的小鼠中去除胚泡，并使用微观手持剂引入了缺少上述丁蝶一下子基因的ES细胞。将其植入了处于伪孕的状态的临时父母的子宫中。根据出生小鼠的外套颜色选择了尽可能高的嵌合速率的雄性小鼠，并试图通过乘法来获得丁香蛋白基因的异性缺陷小鼠，但是尽管反复尝试，但无法获得异质缺陷的小鼠。此外，在去年之后，继续寻找与丁蝶夹细胞内结构域结合的蛋白质，但未鉴定出新的分子。但是，我们已经成功地缩小了丁茶碱在去年揭示的丁茶匙的结合区域，并缩小了三个氨基酸残基。此外，使用各种突变体的实验表明，存在于丁香蛋白的细胞内区域中的B30.2样结构域直接与与黄嘌呤氧化物结合，并且三个高度保守的基序结构在所有人类，小鼠和牛丁香蛋白中都很重要。