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乳脂肪分泌に関わる乳脂肪球皮膜タンパク質の細胞生物学・発生工学的解析

参与乳脂分泌的乳脂球外壳蛋白的细胞生物学和发育工程分析

基本信息

批准号：
11760223
负责人：
青木直人
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

マウスゲノムライブラリーのスクリーニングにより得たブチロフィリンの遺伝子断片を、ブチロフィリン遺伝子と相同組み換えを起こさせるために、ネオマイシン耐性遺伝子(ポジティブセレクション)と単純ヘルペスウィルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を含むターゲッティングベクターに組み込み、PCR法、DNAシークエンシングにより目的とするコンストラクトが構築されていることを確認した。得られたコンストラクトをエレクトロポレーション法により胚性幹細胞(ES細胞)に導入し、その後、ES細胞をG418およびgancyclovirを含むセレクション培地で培養し、薬剤耐性コロニーを得、サザンブロット解析、PCR法により相同組み換えが起きていることを確認した。セロトピン、ゴナドトロピン処理により過剰排卵を誘発したマウスより胚盤胞を摘出し、これに上記で得たブチロフィリン遺伝子を欠損したES細胞を、マイクロマニピュレーターで導入した。これを偽妊娠状態の仮親の子宮へ移植した。生まれたマウスの毛色より判断して出来るだけキメラ率の高い雄マウスを選別し、掛け合わせによりブチロフィリン遺伝子のヘテロ欠損マウスを得ようとしたが、再三の試みにも関わらずヘテロ欠損マウスを得ることは出来なかった。また、昨年度に引き続き、yeast two-hybridスクリーニングを継続し、ブチロフィリンの細胞内ドメインに結合するタンパク質を探索したが、新規分子の同定には至らなかった。しかしながら、昨年度明らかにした、ブチロフィリン上のxanthine oxidaseとの結合領域を3アミノ酸残基にまで絞り込むことに成功した。また、ブチロフィリン細胞内領域に存在するB30.2様ドメインがxanthine oxidaseとの結合に直接関与し、中でもヒト、マウス、ウシブチロフィリンすべてにおいて高度に保存されている3つのモチーフ構造が重要であることを様々なミュータントを用いた実験により明らかにした。

The gene fragments, the gene fragments. The results showed that: (1) the total number of samples collected from the samples was 100, and (2) the total number of samples collected from the samples was 100, and (3) the total number of samples collected from the samples was 100. Embryonic stem cells (ES cells) were introduced into ES cells, and ES cells G418 and gancyclovir were cultured in vitro. Tolerance to ES cells was determined by PCR analysis. The same group of ES cells was identified by PCR analysis. Ovulation is induced in the embryonic stem cells, and the embryonic stem cells are induced in the embryonic stem cells This is a false pregnancy and a false pregnancy. The color of the hair is determined by the color of the hair. In the past year, we have introduced a new molecular identity to the development of a new molecular identity. Xanthine oxidase and its binding domain were successfully synthesized in the presence of 3 amino acid residues. B30.2 is directly related to the combination of xanthine oxidase and xanthine oxidase in the intracellular domain. It is highly conserved in the intracellular domain. The structure of xanthine oxidase is important in the use of xanthine oxidase.