乳癌関連乳脂肪球被膜抗原の発現と食餌成分による変動

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すでに決定しているウシMGP57/53ファミリーのアミノ末端および内在性アミノ酸配列をもとに数種のPCRプライマーをDNAシンセサイザーを用いて合成した。これらのプライマーを用いて、泌乳期のウシ乳腺より調製したポリ(A)+RNAを鋳型として逆転写酵素を用いたRT-PCR法を行った。増幅されたいくつかのバンドをクローニングし、ダイデオキシ法によりシークエンスしたところ、EGF-likeドメインを持つ約800bpの産物が目的とするDNA断片であることが明らかとなった。さらに得られたDNA断片の内部配列をもとに作成したプライマーを用いた5^'-RACE(rapid amplification of cDNA ends)および3^'-RACE法により、サザンブロット陽性バンドを得た。マウスにおけるMGP57/53ファミリーの転写レベル、翻訳レベルにおける変動を解析するために、マウスホモログのクローニングを試みた。ウシPCR産物をプローブとして泌乳期マウスの乳腺より調製したcDNAライブラリーをスクリーニングし、完全長cDNAをクローニングすることに成功した。妊娠期・泌乳期・離乳期を通じて市販固形試料(高炭水化物食)を摂取させたマウスより、妊娠中期、分娩直前、分娩直後、泌乳中期、泌乳後期、離乳直後および1週間後の各時期に乳腺を摘出し、グアニジンイソチオシアネート法により全RNAを抽出し、マウス完全長cDNAをプローブとしてノーザンブロットを行ったところ、MGP57/53は泌乳期特異的に発現することが明らかとなった。また翻訳レベルでの解析を行うために、マウス乳脂肪球被膜よりMGP57/53の単離を試みたが抗体作成に耐えうる量を精製するには至らなかった。そこで大腸菌発現ベクターにインフレームで組み込み、グルタオチン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質の形で発現させることに成功し、現在大量発現・精製を行っている。今後得られた融合タンパク質をウサギに免疫することによって得られる抗血清を用いてMGP57/53の翻訳レベルでの解析を行う。