肝細胞増殖因子の舌癌増殖抑制におけるシグナル伝達系の解析

肝细胞生长因子抑制舌癌生长的信号转导系统分析

• 批准号: 11771142
• 负责人: 大西 智和
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771142/
• 关键词: p21^<waf1>; Stat1; HGF

申請者らは、p21^<waf1>の発現上昇、及び転写因子であるStat1の活性化が、HGFの腫瘍細胞抑制効果と関連のあることを見出している。そこで本研究では、株化舌癌細胞を用い、Stat1とp21^<waf1>の関連性を明らかにすることを目的とした。まず、株化舌癌細胞を用意し、p53のhot spotであるDNA binding siteをRT-PCR法で増幅した後、その部位の塩基配列を確かめた。p53が変異を起こしている舌癌細胞にHGF刺激後、MTTassayにて増殖能を測定し、HGFによる増殖抑制が一番高い細胞を選んだ。選ばれた舌癌細胞にHGFを刺激し、時間を追って核抽出液を得、Stat1が結合するDNAコンセンサス配列をもとにoligonucleotideを合成し、[^<32>P]によってラベルされたoligonucleotideを用いゲルシフトアッセイを行った。その結果、3時間後にピークが認められた。コントロール実験としてはインターフェロン-γによるStat1の活性化を確認した。また、抗Stat1抗体を用いたsupershiftを行った結果、認められたbandがStat1とoligonucleotide複合体であることを確認した。HGF刺激し、細胞内抽出液を抗Stat1抗体で免疫沈降後、SDS-PAGEを行い抗リン酸化Stat1抗体を用いたWesternblotを行った。HGFによるStat1のリン酸化は2時間後にピークを迎えることが判明した。以上の実験の時間的経過から、リン酸化され活性化されたStat1がP21^<waf1>のプロモーター部位のStat1結合領域に作用し、p21^<waf1>の発現が上昇することにより、舌癌細胞におけるHGFの腫瘍増殖抑制効果が起こることが判明した。

申请人发现，p21^<waf1>的表达升高和转录因子STAT1的激活与HGF的肿瘤细胞抑制作用有关。因此，在这项研究中，我们旨在阐明使用舌癌细胞的STAT1和P21^<WAF1>之间的关系。首先，制备舌癌细胞，并通过RT-PCR扩增DNA结合位点，这是P53的热点，并验证了该位点的基础序列。在用p53突变刺激HGF在舌癌细胞上，使用mttassay测量增殖能力，并选择了HGF对增殖最高抑制的细胞。用HGF刺激选定的舌癌细胞，并随着时间的推移获得核提取物，并基于DNA共识序列合成寡核苷酸，并使用使用[^<32> p]标记的寡核苷酸进行了STAT1结合的DNA共有序列。结果，在3小时后观察到峰值。作为对照实验，证实了干扰素-γ的STAT1激活。此外，使用抗STAT1抗体进行超浮标证实，所观察到的带有STAT1和寡核苷酸复合物。刺激HGF，用抗STAT1抗体对细胞内提取物进行免疫沉淀，然后使用抗磷酸化的STAT1抗体对SDS-PAGE进行SDS-PAGE。发现在2小时后，HGF对STAT1的磷酸化峰达到了峰值。从上述实验的时间过程中，发现磷酸化和激活的STAT1作用于P21^<WAF1>启动子部位的STAT1结合区域，并且P21^<WAF1>的表达增加，从而增加了HGF在舌癌癌细胞中HGF的肿瘤生长抑制作用。

项目成果

T.Ohnishi: "Prostaglandin E2 predominantly induces production of hepalocyte Growth factor/scatter factor in human dental pulp in acute inflammation."Journal of Dental Research. 79. 748-755 (2000)

T.Ohnishi：“在急性炎症中，前列腺素 E2 主要诱导人牙髓中肝细胞生长因子/散射因子的产生。”《牙科研究杂志》。

N.Arakaki: "Involvement of oxidative stress in tumor cytotoxic activity of hepatocyte growth factor/scatter factor."Journal of Biological Chemistry. 274. 13541-13546 (1999)

N.Arakaki：“氧化应激参与肝细胞生长因子/分散因子的肿瘤细胞毒活性。”生物化学杂志。