肝細胞増殖因子の舌癌増殖抑制におけるシグナル伝達系の解析

肝细胞生长因子抑制舌癌生长的信号转导系统分析

• 批准号: 11771142
• 负责人: 大西 智和
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771142/
• 关键词: p21^<waf1>; Stat1; HGF

申請者らは、p21^<waf1>の発現上昇、及び転写因子であるStat1の活性化が、HGFの腫瘍細胞抑制効果と関連のあることを見出している。そこで本研究では、株化舌癌細胞を用い、Stat1とp21^<waf1>の関連性を明らかにすることを目的とした。まず、株化舌癌細胞を用意し、p53のhot spotであるDNA binding siteをRT-PCR法で増幅した後、その部位の塩基配列を確かめた。p53が変異を起こしている舌癌細胞にHGF刺激後、MTTassayにて増殖能を測定し、HGFによる増殖抑制が一番高い細胞を選んだ。選ばれた舌癌細胞にHGFを刺激し、時間を追って核抽出液を得、Stat1が結合するDNAコンセンサス配列をもとにoligonucleotideを合成し、[^<32>P]によってラベルされたoligonucleotideを用いゲルシフトアッセイを行った。その結果、3時間後にピークが認められた。コントロール実験としてはインターフェロン-γによるStat1の活性化を確認した。また、抗Stat1抗体を用いたsupershiftを行った結果、認められたbandがStat1とoligonucleotide複合体であることを確認した。HGF刺激し、細胞内抽出液を抗Stat1抗体で免疫沈降後、SDS-PAGEを行い抗リン酸化Stat1抗体を用いたWesternblotを行った。HGFによるStat1のリン酸化は2時間後にピークを迎えることが判明した。以上の実験の時間的経過から、リン酸化され活性化されたStat1がP21^<waf1>のプロモーター部位のStat1結合領域に作用し、p21^<waf1>の発現が上昇することにより、舌癌細胞におけるHGFの腫瘍増殖抑制効果が起こることが判明した。

The applicant showed an increase in the expression of p21<waf1>, and an increase in the activation of stat1, and an increase in the inhibition effect of HGF on tumor cells. The purpose of this study is to clarify the relationship between Stat1 and p21<waf1>. DNA binding site of p53 was amplified by RT-PCR, and gene alignment of p53 was confirmed. p53-induced differentiation in tongue cancer cells stimulated by HGF, MTTassay, and HGF-induced proliferation inhibition Select HGF to stimulate, time to track nuclear extract, Stat1 to bind to DNA sequence, oligonucleotide to synthesize,[^<32>P] to use oligonucleotide to conduct The result is 3 hours later. The activation of Stat1 is confirmed by the activation of Stat1. Anti-Stat 1 antibody supershift results, recognition of Stat1 oligonucleotide complex After HGF stimulation, intracellular extract and anti-Stat 1 antibody precipitation, SDS-PAGE and Western blot were used to detect anti-Stat 1 antibody. HGF Stat1 and Acidification 2 The above results indicate that the activation of Stat1 and p21 <waf1>in the active region of Stat1 binding domain, the increase of p21 expression, and the inhibition of tumor proliferation by <waf1>HGF in tongue cancer cells occur.

项目成果

T.Ohnishi: "Prostaglandin E2 predominantly induces production of hepalocyte Growth factor/scatter factor in human dental pulp in acute inflammation."Journal of Dental Research. 79. 748-755 (2000)

T.Ohnishi：“在急性炎症中，前列腺素 E2 主要诱导人牙髓中肝细胞生长因子/散射因子的产生。”《牙科研究杂志》。

N.Arakaki: "Involvement of oxidative stress in tumor cytotoxic activity of hepatocyte growth factor/scatter factor."Journal of Biological Chemistry. 274. 13541-13546 (1999)

N.Arakaki：“氧化应激参与肝细胞生长因子/分散因子的肿瘤细胞毒活性。”生物化学杂志。