ラット骨基質由来59-KDaシアロタンパクの組換え体作製

源自大鼠骨基质的重组 59-KDa 唾液蛋白的生产

• 批准号: 05771522
• 负责人: 大西 智和
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771522/
• 关键词: 骨; シアロタンパク; リン酸化; 組換え体; pp63

ラット下顎よりリン酸を含まないシアロタンパクとして精製した59-kDaBSPは、そのcDNAのクローニングにより決定された塩基配列から、肝細胞で合成されインスリン受容体のチロシンキナーゼ阻害因子であるpp63と同一の蛋白であることが判明した。そこで、本年度は、本蛋白質の遺伝子組換え体を作成するために、59-kDaBSPをコードするcDNAを動物細胞発現ベクターに組み込み、動物細胞にて本蛋白質を発現させた。まず、動物細胞発現ベクターであるpCNADIに、59-kDaBSPをコードするcDNAをT4DNA ligaseを用いて組み込み、そのベクターを」大腸菌(JM109)を用いて増殖させた。そこで、組み込まれた発現ベクターをアルカリ法にて抽出し、様々な制限酵素を用いて組み込まれたcDNAの方向性を確認した。正しい方向性をもった発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞であるCHO細胞に遺伝子導入し、2日間培養した。その結果、培養液中に、初代培養肝細胞が分泌される59-kDaBSP(pp63)と同程度の59kDaBSPを酵素抗体法(ELISA)により検出した。尚、動物細胞発現ベクターであるpMAM-neoに関しては、そのマルチクローニング部位に存在する制限酵素認識部位の貧困さのために、組み込まれたcDNAの方向性の確認が困難であり遺伝子導入に至っていない。組換え体の分子量及び、燐酸化については現在検討中である。

ラ ッ ト jaw よ り リ を ン acid containing ま な い シ ア ロ タ ン パ ク と し て refined し た 59 - kDaBSP は, そ の cDNA の ク ロ ー ニ ン グ に よ り decided さ れ た salt base with column か ら, liver cell で synthetic さ れ イ ン ス リ ン by let body の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ resistance against factor で あ る pp63 と same の protein で あ る こ と が.at し た . そ こ で, this year's は, traces of this protein の 伝 subgroups in え body を made す る た め に, 59 - kDaBSP を コ ー ド す る cDNA を animal cell 発 now ベ ク タ ー に group み 込 み, animal cells に て this protein を 発 now さ せ た. ま ず, animal cells 発 now ベ ク タ ー で あ る pCNADI に, 59 - kDaBSP を コ ー ド す る cDNA を T4DNA ligase を with い て group み 込 み, そ の ベ ク タ ー を "coliform (JM109) を い て raised colonization さ せ た. そ こ で, group み 込 ま れ た 発 now ベ ク タ ー を ア ル カ リ method に て spare し, others 々 を limitations な enzyme with い て group み 込 ま れ た cDNA の directional を confirm し た. Is し い directional を も っ た 発 now ベ ク タ ー を, チ ャ イ ニ ー ズ ハ ム ス タ ー eggs 巣 origin cells で あ る CHO cells に heritage 伝 import し, 2 day training し た. そ の に, original training in results, cultures of liver cell secretion が さ れ る 59 - kDaBSP (pp63) と with degree of 59 の kDaBSP を enzyme antibody technique (ELISA) に よ り 検 out し た. Is, animal cells 発 now ベ ク タ ー で あ る pMAM - neo に masato し て は, そ の マ ル チ ク ロ ー ニ ン に グ parts exist す limitations る enzyme known parts の poverty さ の た め に, group み 込 ま れ た cDNA の directional の confirm が difficult で あ り heritage 伝 son import に to っ て い な い. The molecular weight of the え body of the group and the び and phosphorescence of the に え て て て are currently in 検 discussion である.