ラット骨基質由来59-KDaシアロタンパクの組換え体作製

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ラット下顎よりリン酸を含まないシアロタンパクとして精製した59-kDaBSPは、そのcDNAのクローニングにより決定された塩基配列から、肝細胞で合成されインスリン受容体のチロシンキナーゼ阻害因子であるpp63と同一の蛋白であることが判明した。そこで、本年度は、本蛋白質の遺伝子組換え体を作成するために、59-kDaBSPをコードするcDNAを動物細胞発現ベクターに組み込み、動物細胞にて本蛋白質を発現させた。まず、動物細胞発現ベクターであるpCNADIに、59-kDaBSPをコードするcDNAをT4DNA ligaseを用いて組み込み、そのベクターを」大腸菌(JM109)を用いて増殖させた。そこで、組み込まれた発現ベクターをアルカリ法にて抽出し、様々な制限酵素を用いて組み込まれたcDNAの方向性を確認した。正しい方向性をもった発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞であるCHO細胞に遺伝子導入し、2日間培養した。その結果、培養液中に、初代培養肝細胞が分泌される59-kDaBSP(pp63)と同程度の59kDaBSPを酵素抗体法(ELISA)により検出した。尚、動物細胞発現ベクターであるpMAM-neoに関しては、そのマルチクローニング部位に存在する制限酵素認識部位の貧困さのために、組み込まれたcDNAの方向性の確認が困難であり遺伝子導入に至っていない。組換え体の分子量及び、燐酸化については現在検討中である。