単球の炎症性サイトカイン産生能に及ぼす歯周病原細菌熱ショックタンパクの影響

牙周病原菌热休克蛋白对单核细胞产生炎性细胞因子能力的影响

• 批准号: 11771358
• 负责人: 中島 貴子
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771358/
• 关键词: 歯周炎; 熱ショックタンパク; Porphyromonas gingivalis; Actinobacillus actinomycetemcomitans; 炎症性サイトカイン; 単球

1.歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisとActinobacillus actinomycetemcomitansの熱ショックタンパク(hsp)GroELホモログの組み換えタンパクの精製(1)P.GingivalisとA.ActinomycetemcomitansからゲノムDNAを抽出し、GroELホモログタンパク質をコードするcDNAを増幅するために設計したプライマーを用いてゲノムDNAをPCR増幅した。(2)PCR産物を精製後、発現用ベクター(pRSET)に組み込み、大腸菌で発現させてヒスチジンタグの付加されたfusion proteinを合成し、ニッケルキレートカラムで精製した。(3)さらに大腸菌のLPSの混入を除去するためにポリミキシンBアフィニティカラムで精製した。(4)以上の操作をくり返し、以降の刺激実験に使用するに十分量のP.GingivalisとA.ActinomycetemcomitansのGroELホモログの組み換えタンパクを得た。2.歯周病原細菌由来hsp刺激が、単球系細胞株のサイトカイン産生に及ぼす影響の解析(1)1で精製したP.GingivalisとA.Actinomycetemcomitans由来の組み換えhspにてヒト単球由来の細胞株THP-1を刺激培養した。(2)炎症性サイトカインIL-1α,β、TNF-α、IL-6、IL-8、GM-CSFの産生を調べるために培養細胞よりAGPC法により全RNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。(3)各サイトカイン特異的プライマーを用いて半定量的PCR増幅を行い、アガロースゲル電気泳動後エチジウムブロマイド染色して、解析中である。

1. Peridental pathogenic bacteria Porphyromonas gingivalis and Actinobacillus actinomycetemcomitans: heat treatment (hsp)GroEL: purification of the composition of the genome (1) P. Gingivalis and A.Actinomycetemcomitans: DNA extraction, DNA amplification, cDNA design, cDNA amplification. (2)PCR products were purified and then purified by PCR (pRSET). (3)In addition, the LPS of Escherichia coli was removed and purified. (4)The above operations are carried out in order to reduce the use of stimuli. A tenth of the P. Gingivalis and A.Actinomycetemcomitans are used in the preparation of the drug. 2. Analysis of the effects of hsp stimulation on the production and growth of cell lines derived from peripheral pathogenic bacteria (1) Purification of P. Gingivalis and A.Actinomycetemcomitans derived from hsp stimulation on the culture of cell line THP-1. (2)The production of inflammatory cytokines IL-1α,β, TNF-α, IL-6, IL-8 and GM-CSF is regulated by AGPC, which extracts whole RNA, reverse encodes enzymes and synthesizes cDNA. (3)The PCR amplification was carried out in semi-quantitative PCR amplification, and the PCR amplification was carried out in semi-quantitative PCR amplification.