単球の炎症性サイトカイン産生能に及ぼす歯周病原細菌熱ショックタンパクの影響

1.歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisとActinobacillus actinomycetemcomitansの熱ショックタンパク(hsp)GroELホモログの組み換えタンパクの精製(1)P.GingivalisとA.ActinomycetemcomitansからゲノムDNAを抽出し、GroELホモログタンパク質をコードするcDNAを増幅するために設計したプライマーを用いてゲノムDNAをPCR増幅した。(2)PCR産物を精製後、発現用ベクター(pRSET)に組み込み、大腸菌で発現させてヒスチジンタグの付加されたfusion proteinを合成し、ニッケルキレートカラムで精製した。(3)さらに大腸菌のLPSの混入を除去するためにポリミキシンBアフィニティカラムで精製した。(4)以上の操作をくり返し、以降の刺激実験に使用するに十分量のP.GingivalisとA.ActinomycetemcomitansのGroELホモログの組み換えタンパクを得た。2.歯周病原細菌由来hsp刺激が、単球系細胞株のサイトカイン産生に及ぼす影響の解析(1)1で精製したP.GingivalisとA.Actinomycetemcomitans由来の組み換えhspにてヒト単球由来の細胞株THP-1を刺激培養した。(2)炎症性サイトカインIL-1α,β、TNF-α、IL-6、IL-8、GM-CSFの産生を調べるために培養細胞よりAGPC法により全RNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。(3)各サイトカイン特異的プライマーを用いて半定量的PCR増幅を行い、アガロースゲル電気泳動後エチジウムブロマイド染色して、解析中である。

1.歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisとActinobacillus actinomycetemcomitansの熱ショックタンパク(hsp)GroELホモログの組み換えタンパクの精製(1)P.GingivalisとA.ActinomycetemcomitansからゲノムDNAを抽出し、GroELホモログタンパク質をコードするcDNAを増幅するために設計したプライマーを用いてゲノムDNAをPCR増幅した。(2)PCR産物を精製後、発現用ベクター(pRSET)に組み込み、大腸菌で発現させてヒスチジンタグの付加されたfusion proteinを合成し、ニッケルキレートカラムで精製した。(3)さらに大腸菌のLPSの混入を除去するためにポリミキシンBアフィニティカラムで精製した。(4)以上の操作をくり返し、以降の刺激実験に使用するに十分量のP.GingivalisとA.ActinomycetemcomitansのGroELホモログの組み換えタンパクを得た。2.歯周病原細菌由来hsp刺激が、単球系細胞株のサイトカイン産生に及ぼす影響の解析(1)1で精製したP.GingivalisとA.Actinomycetemcomitans由来の組み換えhspにてヒト単球由来の細胞株THP-1を刺激培養した。(2)炎症性サイトカインIL-1α,β、TNF-α、IL-6、IL-8、GM-CSFの産生を調べるために培養細胞よりAGPC法により全RNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。(3)各サイトカイン特異的プライマーを用いて半定量的PCR増幅を行い、アガロースゲル電気泳動後エチジウムブロマイド染色して、解析中である。