結晶構造解析によるノンヘム鉄を含む2原子酸素添加酵素LigABの反応機構解析

通过晶体结构分析含非血红素铁的双原子加氧酶LigAB的反应机理

• 批准号: 11780425
• 负责人: 千田 俊哉
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780425/
• 关键词: 蛋白結晶学; 立体構造; 構造活性相関; 2原子酸素添加酵素; 部位特異的変異法; Extradiol型dioxygenase; 無酸素条件; X線結晶構造解析; 基質複合体; 反応中間体; 変異体蛋白質

1.LigABの高分解能構造と変異体を用いた構造活性相関研究現在までに得られているLigABの構造は、2.2Å分解能であり、詳細な構造を議論するためには不十分である。そこで、分解能を改善して詳細な原子レベルでの立体構造を決定する為に、回折データ測定の条件を検討し直した。LigABの回折データ測定は、この結晶の空間群の関係から非常に長い時間がかかる。そこで、出来るだけ結晶のX線に対するダメージを減らすために、100Kでの測定を行うこととし、その条件を検討した。その結果、放射光と100Kでの低温測定を併用することで、1.3Å分解能でのデータ測定に成功した。現在、1.3Å分解能において結晶構造の精密化を進めている。2.変異体を用いた構造活性相関研究LigABの触媒反応機構を探るため、活性中心付の残基に関して10種類以上の変異体を作成し、LigABの立体構造と機能の相関を解析した。その結果、以前から我々が主張していたように、LigABの触媒反応にはHis195が必須で、この残基は触媒塩基であることが強く示唆された。これは、LigABの触媒反応が、Class IIのextradiol型dioxygenaseであるBphCと本質的には同じ機構で反応が進むことを強く示唆するものである。また、基質の結合には、疎水的な相互作用よりも、基質のカルボン酸と蛋白質の間に形成される水素結合が重要であることを示唆する結果も得られた。3.活性型LigAB結晶の作成の試み精製後のLigABは、活性中心のノンヘム鉄(II)の酸化によりかなり活性が下がってしまっている。活性型の結晶構造を得るためには、活性化の減少したLigABを再活性化する技術が不可欠であるため、このこの技術の確立を行った。その結果、昨年度作成した無酸素チャンバー内において、LigABとFe(II)溶液を混合することで活性型LigABを得ることに成功した。現在、無酸素条件下で活性型LigABの結晶化条件の探索を行っている。

1. LigAB の high decomposition can construct と - variant を with い た tectonic active phase masato research now ま で に have ら れ て い る LigAB は の structure, 2.2 A decomposition can で あ り, detailed talk な tectonic を す る た め に は not quite で あ る. そ こ で, decomposition can を improve し て detailed な atomic レ ベ ル で の three-dimensional structure を decided す る に, inflexion デ ー の condition in determination of タ を beg し 検 straight し た. LigAB <s:1> fold back デ タ タ タ to determine the <s:1> and <s:1> crystalline <s:1> space group <e:1> relationship ら ら for a very に long <s:1> time が が る る る る. そ こ で, out る だ け crystallization の X-ray に す seaborne る ダ メ ー ジ を minus ら す た め に, 100 k で の measurement line を う こ と と し, そ の conditions を beg し 検 た. そ の results, radiation light と 100 k で の cryogenic を and す る こ と で, 1.3 A decomposition can で の デ ー タ determination に successful し た. Now, 1.3A decomposition can にお て て crystalline structure <s:1> precision を into めて る る る. 2. - variant を with い た tectonic activity phase masato LigAB の catalyst を 応 authorities agent る た め, active center の residues に masato し て above 10 kinds の - variant を し, consummate LigAB の three-dimensional structure と function の phase masato を parsing し た. そ の results, before か ら I 々 が advocated し て い た よ う に, LigAB の catalyst against 応 に は His195 が must で, こ の residues は catalytic salt base で あ る こ と が く and shown strong sucking さ れ た. こ れ は, LigAB の catalyst against 応 が の, Class II type extradiol dioxygenase で あ る BphC と essential に は with じ institutions で anti 応 が into む こ と を く and shown strong sucking す る も の で あ る. ま た, combined matrix の に は, water 疎 な interaction よ り も, matrix の カ ル ボ ン acid と に formed between protein の さ れ る water element combination が important で あ る こ と を in stopping す る results ら も れ た. 3. Type reactive crystallization LigAB の done try の み refined after の LigAB は, active center の ノ ン ヘ ム iron objects (II) の acidification に よ り か な り under active が が っ て し ま っ て い る. Active type の crystallization structure を る た め に は, active の reduce し た LigAB を again activeness す る technical が owe で あ る た め, こ の こ の technology の line established を っ た. そ の results, yesterday's annual し た acid free element チ ャ ン バ ー within に お い て, LigAB と Fe (II) solution mixed を す る こ と で activity type LigAB を must る こ と に successful し た. Now, under acid-free conditions, the <s:1> crystallization conditions <e:1> of で active LigAB are being explored for を and って る る.

项目成果

Yamada,T.: "Purification and crystallization of a ferredoxin reductase component of a biphenyl dioxygenase derived from Pseudomonas sp.strain KKS102."Protein Peptide Lett.. 7. 227-280 (2000)

Yamada，T.：“源自假单胞菌菌株 KKS102 的联苯二加氧酶的铁氧还蛋白还原酶组分的纯化和结晶。”Protein Peptide Lett.. 7. 227-280 (2000)

Uragami,Y.: "Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase."J.Inorg.Biochem.. (In press).

Uragami,Y.：“重新激活的 BphC（一种额外二醇型环裂​​解双加氧酶）的无底物和复杂形式的晶体结构。”J.Inorg.Biochem..（正在出版）。

Ohtsubo Y.: "PcpA, which is involved in the degradation of pentachlorophenol in Sphingomonas chlorophenolica ATCC39723, is a novel type of ring-cleavage dioxygenase"FEBS Letters. 459. 395-398 (1999)

Ohtsubo Y.：“PcpA 参与氯酚鞘氨醇单胞菌 ATCC39723 中五氯苯酚的降解，是一种新型的环裂解双加氧酶”FEBS Letters。

千田俊哉: "生物マシーナリー研究"結晶学会誌. 43. 38-44 (2001)

Toshiya Chida：《生物机械研究》晶体学会杂志 43. 38-44 (2001)。

Sugimoto K.: "Purification and crystallization of a protocatechuate 4,5-dioxygenase LigAB from Sphingomonas pausimobilis SYK-6"Protein and Peptide Lett.. 6. 55-58 (1999)

Sugimoto K.：“来自少动鞘氨醇单胞菌 SYK-6 的原儿茶酸 4,5-双加氧酶 LigAB 的纯化和结晶”蛋白质和肽快报.. 6. 55-58 (1999)