無酸素条件下における新規結晶化法の開発

缺氧条件下新结晶方法的开发

• 批准号: 18657036
• 负责人: 千田 俊哉
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18657036/
• 关键词: 結晶成長; 無酸素条件; 結晶化; 酸化還元; フェレドキシン; フェレドキシン還元酵素

これまでの実験から、無酸素条件下の結晶化では、サンプル状態の的確な把握が重要であることが明らかになった。特に酸化還元に関与するタンパク質の場合、酸化還元状態の違いが結晶化に大きな影響を与える。そこで無酸素チャンバー内で分光測定が簡便に行えるようなシズテムが必要なため、チャンバー内でのUV-vis吸収スペクトルの測定結果をチャンバー外のPCに転送可能なシステムを構築した。無酸素条件下で作成した結晶を外部に持ち出す際には、ガラス製のディプレッショングラスに真空グリース(Apiezon社製)を用いて封をすることで、長期間(1週間以上)安全に持ち出せることがわかった。この方式を用いればチャンバー外部の顕微鏡等で色、形状等の詳しい観察が容易になる。ガラスの材質を変更すれば、無酸素状態を保ったまま結晶の分光測定を可能にするセルを作成する事ができると考えられた。今年度はフェレドキシン-フェレドキシン還元酵素系以外への応用として、鉄硫黄クラスターを含むtRNA修飾酵素(SAM)を用いて、無酸素条件下で鉄硫黄クラズター再構成、結晶化を試み、これらを成功させた。これに加え、D-アスパラギン酸酸化酵素(DDO)の結晶化を嫌気条件下で行い、結晶を得る事に成功した。対照実験として行った酸素存在下での結晶化と比較したところ、嫌気条件下での結晶化のほうが再現性よく結晶が得られる事が判明した。これは、タンパク質に対する酸化ストレズの低下が主たる原因と考えられるが、詳しくは更に分析を進める必要がある。更に、無酸素条件下で得たDDOの結晶を用いて結晶構造決定に成功した。いくつかの反応中間体結晶も無酸素条件下で作成し構造決定した。

こ れ ま で の be 験 か ら, acid free element under the condition of の crystallization で は, サ ン プ ル state の な really grasp the important で が あ る こ と が Ming ら か に な っ た. Has に acidification is yuan に masato and す る タ ン パ ク の occasions, acidification and yuan state の violations い が crystallization に big き な influence を and え る. そ こ で acid free element チ ャ ン バ ー で spectral measurement within easy が に line え る よ う な シ ズ テ ム が necessary な た め, チ ャ ン バ ー within で の UV - vis absorption 収 ス ペ ク ト ル の determination results を チ ャ ン バ ー の outside PC に planning may send な シ ス テ ム を build し た. Under the condition of acid free element で made し た crystallization を external に hold ち out す interstate に は, ガ ラ ス system の デ ィ プ レ ッ シ ョ ン グ ラ ス に vacuum グ リ ー ス (Apiezon club system) を い て sealing を す る こ と で, long-term (more than 1 week between) between safety に hold ち out せ る こ と が わ か っ た. The <s:1> method を uses the を ればチャ バ バ バ を external <s:1> 顕 micromirror, etc. Youdaoplaceholder4 color, shape, etc. are detailed. Youdaoplaceholder5 観 観 observation が is easy to になる. ガ ラ ス の material を - more す れ ば, acid free state を bartender っ た ま ま crystallization の spectral photometry を may に す る セ ル を made す る matter が で き る と exam え ら れ た. Our は フ ェ レ ド キ シ ン - フ ェ レ ド キ シ ン yuan enzyme is also outside へ の 応 with と し て objects, iron sulfur ク ラ ス タ ー を containing む tRNA modification enzyme (SAM) を い て objects, under the condition of acid free element で iron sulfur ク ラ ズ タ ー again structure, crystallization を み, こ れ ら を successful さ せ た. こ れ に え, D - ア ス パ ラ ギ ン acid acidification enzyme (DDO) の crystallization を too 気 で い, under the condition of crystallization を る matter に successful し た. Line according to be seaborne 験 と し て っ た element in the presence of acid で の crystallization と compare し た と こ ろ, anaerobic 気 conditions で の crystallization の ほ う が reproducibility よ く crystallization が must ら れ る matter が.at し た. こ れ は, タ ン パ ク qualitative に す seaborne る acidification ス ト レ ズ の low が main た る reason と exam え ら れ る が and detailed し く は more に analysis を め る necessary が あ る. Under conditions of に and without acid, で can obtain たDDO <s:1> crystals を, and the に successful た た is determined by the structure of て て crystals. The <s:1> く く く 応 応 応 <s:1> crystallization of the reverse 応 intermediate で under acid-free conditions で forms a <s:1> struction-determined <s:1> た.

项目成果

Crystallization and preliminary X-ray analysis of the reduced Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin derived from Pseudomonas sp strain KKS102

• DOI: 10.1107/s1744309107009992
• 发表时间: 2007-04-01
• 期刊: ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION F-STRUCTURAL BIOLOGY COMMUNICATIONS
• 影响因子: 0.9
• 作者: Senda, Miki;Kishigami, Shinya;Senda, Toshiya
• 通讯作者: Senda, Toshiya

Crystallization and preliminary X-ray analysis of the Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin component of biphenyl dioxygenase from Pseudomonas sp. Strain KKS102.

假单胞菌联苯二加氧酶的 Rieske 型 [2Fe-2S] 铁氧还蛋白组分的结晶和初步 X 射线分析。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Acta Crystallographica section F 62
• 作者: M.Senda;S.Kumura;S.Kishigami;T.Senda
• 通讯作者: T.Senda

Crystallization and preliminary crsytallographic analysis of a haloalkane dehalogenase, DbjA, from Bradyrhizobium japonicum USDA110.

来自日本慢生根瘤菌 USDA110 的卤代烷脱卤酶 DbjA 的结晶和初步晶体学分析。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Acta Crystallographica section F 63
• 作者: Y.Sato;R.Natsume;M.Tsuda;J.Damborsky;Y.Nagata;T.Senda
• 通讯作者: T.Senda

フェレドキシン還元酵素とフェレドキシンの複合体構造と酸化還元依存的親和性調節機構の解明

阐明铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白的复杂结构以及氧化还原依赖性亲和力调节机制

• 发表时间: 2007
• 作者: Y.Sato;R.Natsume;M.Tsuda;J.Damborsky;Y.Nagata;T.Senda;千田 美紀
• 通讯作者: 千田 美紀

Crystal structure of the radical SAM enzyme catalyzing tricyclic modified base formation in tRNA

• DOI: 10.1016/j.jmb.2007.07.024
• 发表时间: 2007-10-05
• 期刊: JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.6
• 作者: Suzuki, Yoko;Noma, Akiko;Nureki, Osamu
• 通讯作者: Nureki, Osamu