2原子酸素添加酵素の反応中間体結晶構造に基づいた触媒反応機構解析

基于双加氧酶反应中间体晶体结构的催化反应机理分析

• 批准号: 15770077
• 负责人: 千田 俊哉
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770077/
• 关键词: X線結晶構造解析; 2原子酸素添加酵素; 反応中間体構造; エクストラジオール型; 芳香族分解系; ノンヘム鉄; 阻害剤; 配位構造; 反応機構; 反応中間体; 構造生物学

Extradiol型2原子酸素添加酵素は、芳香族化合物の代謝においてキーとなる酵素で、古くから精力的に研究されてきた。これらの酵素は活性中心に2価のノンヘム鉄を含んでおり、カテコール環に酸素原子を2個付加することで芳香環を開裂する。本研究では、extradiol型2原子酸素添加酵素の反応中間体構造を超高分解能で決定し、extradiol型2原子酸素添加酵素の触媒反応機構を明らかにすることを目指した。まず超高分解能の結晶構造を決定する為に、BphCの精製度を上げて結晶化を行った。その結果、分解能を1.45Åから1.3Å分解能まであげる事に成功した。この結晶を用いることで、活性中心の詳細な構造を決定する事が出来た。特に、低酸素濃度下で決定した構造では、これまで分子種が不明(O_2もしくはO_2^-である可能性を否定できなかった)であった鉄めリガンドが、OもしくはOHである事がはっきりと示された。また、本研究期間中に共同研究者により、4-メチルカテコールや、4-クロロカテコールが、BphCのユニークな阻害剤である事が示された。この知見は、本酵素の工学的応用に重要であるため、これらの阻害剤の触媒反応阻害機構を立体構造に基づき解析した。これらの阻害剤とBphCとの複合体の高分解能結晶構造の決定を行った結果、驚くべき事にこれらの4位置換阻害剤は、通常の基質と結合様式が全く異なっていることが明らかになった(論文準備中)。具体的には、4位置換の阻害剤の場合は、2つの水酸基が鉄イオンを中心としたOctahedralの配位構造中で共にequatorialの位置を占めていることが明らかになった(基質では、1つの水酸基がaxialに、他方の水酸基がequatorialな位置に結合する)。このような阻害形式は、初めて見いだされたもので極めて興味深い。構造を検討した結果、この異常な結合様式は、基質ポケットの形状に起因するとものと考えられた。この結果、基質結合ポケットの形状を変える事で、特定の基質に対して耐性の(失活しにくい)酵素を設計できる可能性があることが示された。

Extradiol type 2 atomic acid added enzyme は, aromatic compounds の metabolic に お い て キ ー と な で る enzyme, ancient く か ら energy に research さ れ て き た. は こ れ ら の enzyme active center に 2 価 の ノ ン ヘ ム iron objects を containing ん で お り, カ テ コ ー ル element atoms を に acid 2 plus す る こ と で aromatic ring を cracking す る. This study で は, extradiol type 2 atomic acid element added enzyme の 応 intermediate structure を ultra-high decomposition can で し decision, extradiol type 2 atomic の acid, adding enzyme catalytic を 応 authorities Ming ら か に す る こ と を refers し た. The まず ultra-high decomposition energy <s:1> crystalline structure を determines that する is に, and the げて crystallization を row った on the を of the BphC crystal system った. Youdaoplaceholder0 そ result, decomposition energy を1.45 A ら ら1.3 A decomposition energy まであげる event に success た た. The <s:1> <s:1> crystal を is determined by the を る とで とで とで and the detailed な structure of the active center を を to determine the する event が out た. に, low acid, element concentrations で decided し た tectonic で は, こ れ ま で molecules of unknown が (O_2 も し く は O_2 ^ - で あ る possibility を negative で き な か っ た) で あ っ た iron objects め リ ガ ン ド が, O も し く は OH で あ る matter が は っ き り と shown さ れ た. ま た, this study during に common researchers に よ り, 4 - メ チ ル カ テ コ ー ル や, 4 - ク ロ ロ カ テ コ ー ル が, BphC の ユ ニ ー ク な resistance against tonic で あ が る things in さ れ た. こ の knowledge は, this enzyme の engineering 応 with important で に あ る た め, こ れ ら の resistance against tonic の catalyst を 応 resistance against authorities three-dimensional structure に base づ き parsing し た. こ れ ら の resistance against tonic と BphC と の complex の high decomposition can crystal structure line の decided を っ た results, jing く べ き matter に こ れ ら の 4 position in resistance against tonic は, usually の と matrix combined with others in type が く all different な っ て い る こ と が Ming ら か に な っ た (prepare). Specific に は, 4 position in の resistance against は tonic の occasions, 2 つ の water acid radical が iron objects イ オ ン を center と し た Octahedral の ligand structure in で altogether に equatorial を の position of め て い る こ と が Ming ら か に な っ た (matrix で は, 1 つ の water acid radical が axial に, fang の water acid base が equatoria (lな position に combined with する). <s:1> ような the forms of damage resistance ような, initial めて, めて, だされた, <s:1> で, で, extremely めて, are deeply interested in めて. The construction を検 discusses the results of the た, the <s:1> <s:1> anomaly な combination pattern, the shape of the matrix ポケット <s:1> に the cause すると <s:1> と と is examined えられた. こ の results, as well as the combination of matrix ポ ケ ッ ト の shape を - え で る, specific の matrix に し seaborne て patience の (inactivation し に く い) enzyme を design で き る possibility が あ る こ と が shown さ れ た.

项目成果

千田俊哉: "集合系マシーナリとしての芳香族化合物分解系-ジオキシゲナーゼを中心として-"結晶学会誌. 45. 71-75 (2003)

Toshiya Chida：“作为集体机械的芳香族化合物分解系统 - 关注双加氧酶 -”《晶体学会杂志》45. 71-75 (2003)。

Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of human oncoprotein SET/TAF-1 beta.

人癌蛋白 SET/TAF-1 beta 的纯化、结晶和初步 X 射线衍射分析。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Acta Crystallogr D60
• 作者: Furusawa;Y.;Muto S.
• 通讯作者: Muto S.

Crystal structure of a γ-butyrolactone autoregulator receptor protein in Streptomyces coelicolor A3(2)

• DOI: 10.1016/j.jmb.2003.12.040
• 发表时间: 2004-02-13
• 期刊: JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.6
• 作者: Natsume, R;Ohnishi, Y;Horinouchi, S
• 通讯作者: Horinouchi, S

Nagarajan, V.: "Crystallization of the terminal oxygenase component of biphenyl dioxygenase derived from Rhodococcus sp. strain RHA1."Protein and Peptide Letters. 10. 412-417 (2003)

Nagarajan, V.：“源自红球菌属菌株 RHA1 的联苯二加氧酶末端加氧酶成分的结晶。”蛋白质和肽快报。

Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of Methanococcus janashii TATA box-binding protein (TBP).

janashii 甲烷球菌 TATA 盒结合蛋白 (TBP) 的纯化、结晶和初步 X 射线分析。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Acta Crystallogr D60
• 作者: Natsume;R.;Adachi N.
• 通讯作者: Adachi N.