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Mechanistic study of quaternary structure changes of a LysR- type transcriptional regulator

LysR型转录调节因子四级结构变化的机制研究

基本信息

批准号：
22H02563
负责人：
千田俊哉
金额：
$ 10.82万
依托单位：
High Energy Accelerator Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

バクテリアに広く分布するLysR型転写制御因子（LTTR）の転写活性化機構は、主として生化学的な手法により解析されてきたが、これまでに得られている生化学的な結果を説明する分子メカニズムは30年以上にわたり不明のままである。これに答える為には、LTTRとプロモータDNA複合体の立体構造に加え、誘導物質によりどのようにLTTRの構造が変化しRNAポリメラーゼと相互作用するかなどに関して、原子レベルの構造的理解が不可欠である。そこで本研究では、我々のグループが長年研究してきたLTTRであるCbnR４量体を取り上げ、結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡（電顕）の解析技術を用いて、（１）CbnR４量体の構造多型解析、（２）CbnR４量体と誘導物質（ムコン酸）との複合体構造解析、（３）CbnR４量体、誘導物質（ムコン酸）、プロモータDNAとの３者複合体構造解析、（４）プロモータDNA上のABS配列とCbnRのDNA結合ドメインとの複合体構造解析などを達成することを目指している。初年度は、これら４つのうちで最も困難かつ時間がかかると考えられる、（３）CbnR４量体、誘導物質（ムコン酸）、プロモータDNAとの３者複合体構造解析のための試料調製に集中して研究を進めた。これまでの研究からCbnR４量体－プロモータDNAの結晶構造は低分解能でしか得られていないこと、今後に考えられるRNAポリメラーゼを含んだ複合体の構造解析へのスムーズな移行のため、クライオ電顕による解析を目指した試料調製を行った。その結果、外来DNAの混入の少ないCbnRの精製法を確立し、透析とゲル濾過を組みあわせてCbnR４量体－プロモータDNA複合体の調製などを行うことができた。電子顕微鏡を用いた負染色像の撮影では、CbnR４量体らしき像を確認することができた。

LysR type control factor (LTTR) activation mechanism, main biochemical analysis methods, biochemical results, molecular analysis methods, molecular analysis methods, molecular analysis methods, The structure of LTTR is changed due to the interaction between RNA and LTTR, and the structure of LTTR is not understood due to the addition and induction of substances. In this study, we have been studying for many years. We have been studying the structure of CbnR4 quantum, crystal structure analysis, electron microscope (electron microscope) analysis technology,(1) structural polymorphism analysis of CbnR4 quantum,(2) structural analysis of complex of CbnR4 quantum and inducer,(3) structural analysis of complex of CbnR4 quantum, inducer and inducer.(4) ABS alignment on DNA, DNA binding to CbnR, and complex structure analysis. In the beginning of the year, the most difficult time is to study the concentration of (3) CbnR4 quantity, inducing substance (methyl ester acid) and DNA complex. This study is aimed at analyzing the structure of CbnR4-DNA, including the structure analysis of complex, the transition of DNA, the analysis of RNA, and the modulation of samples. As a result, the purification method of foreign DNA was established, dialysis and filtration were performed, and the modulation of CbnR4 DNA complex was performed. The negative staining image of electron microscope is detected by CbnR4.