蛍光共鳴エネルギー転移を応用したイノシトール三リン酸の細胞内動態のイメージング

使用荧光共振能量转移对三磷酸肌醇的细胞内动力学进行成像

• 批准号: 13877314
• 负责人: 東城 庸介
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Health Sciences University of Hokkaido
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877314/
• 关键词: FRET; イノシトール1,4,5-三リン酸; GFP; CFP; YFP; イメージング; イノシトール三リン酸

蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)を利用してイノシトール1、4、5-三リン酸(IP_3)のバイオイメージングを試みた。1)Cyan Fluorescent Protein (CFP)の遺伝子の3'末端にYellow Fluorescence Protein (YFP)の遺伝子を融合させ、さらにその5'末端に細胞膜局在シグナル遺伝子を融合させたCFP-YFP融合タンパク質発現ベクターを作成した。2)RatのIP_3受容体タイプ3(IP_3R type 3)をテンプレートとして、PCRを用いてIP_3Rのリガンド結合ドメインをコードする遺伝子断片を作成した。3)IP_3Rの遺伝子断片をCFP-YFP融合タンパク質の発現ベクターに挿入し、CFP-IP_3Rリガンド結合ドメイン-YFPを細胞膜に発現させるベクターを作成した。4)融合タンパク質をヒト耳下腺培養細胞(HSY細胞)に発現させ、425nmの励起光でCFPを励起したところ480nmのCFPの蛍光に加えて、525nmのYFPの蛍光が認められた。このことからCFP-IP_3Rリガンド結合ドメイン-YFP融合タンパク質でFRETが起こっていることがわかった。5)融合タンパク質発現細胞をサポニンで穿孔し、IP_3で刺激したところ、IP_3の濃度に依存したFRET効率の変化(YFP蛍光の減弱)が認められた。以上の結果から、FRET現象を利用したIP_3の可視化プローブの作成が可能であることが示唆された。

The fluorescence resonance energy transfer (FRET) was used to study the fluorescence characteristics of 1,4,5-trinitrotoluene (IP_3). 1)Cyan Fluorescent Protein (CFP) 3'end Yellow Fluorescence Protein (YFP) 3' end fusion protein, CFP-YFP fusion protein fusion 2) The IP_3 receptor type 3(IP_3R type 3) of Rat was selected for PCR amplification. 3)IP_3R gene fragment CFP-YFP fusion protein and protein development in vitro, CFP-IP_3R gene fragment CFP-YFP fusion protein and protein development in vitro. 4)The fusion protein was detected in cultured cells (HSY cells) by CFP excitation at 425nm, CFP excitation at 480nm, and YFP excitation at 525 nm. CFP-IP_3R fusion technology is the most important technology in the world. 5)The expression of fusion protein in cells depends on IP_3 concentration, and the expression of FRET depends on IP_3. The above results show that it is possible to make use of the FRET phenomenon.