小脳特異的な低域値型カルシウムチャネルノックアウトマウスの作製と機能解析

小脑特异性低阈值钙通道敲除小鼠的产生及功能分析

基本信息

批准号：
13878165
负责人：
狩野方伸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、低閾値型カルシウムチャネルα1Gの小脳機能における役割を明らかにするため、α1G遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの作製を目的としている。昨年度、相同組み換えを生じた2種のES細胞クローンを用いて、キメラマウスの作製を行ったが、どのクローン由来のキメラマウスも生殖系列へのES細胞伝達を示さなかった。今年度は、昨年作製したターゲッティングベクターの相同組み換え領域を2kb延長して、再度ES細胞で相同組み換え体をクローニングした。その結果、おおよそ1%の確率で相同組み替えを生じたES細胞がクローニングできた。クローニングしたES細胞を用いて、マウス胚盤胞へのインジェクションを行ったところ、現在、ES細胞の寄与率の高いキメラマウスが誕生している。今後はこのキメラマウスを野生型マウスと交配してヘテロマウスを作製する予定である。さらに、小脳プルキンエ細胞特異的にα1G遺伝子を欠損させるため、プルキンエ細胞特異的にCre組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウスのベクターの作製も行った。今後は、このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作出し、上記のヘテロマウスと交配させる予定である。さらにα1Gサブユニット特異的な力価の高い抗体が存在しないため、α1G細胞内ループ領域を抗原タンパクとして大腸菌で合成し、ウサギを用いてポリクローナル抗体の作製を行った。作製し精製した抗体は、Western blot法により小脳抽出物中のα1Gサブユニットだと考えられる260kDaのバンドを特異的に認識した。今後は、ノックアウトマウスの解析に有効に使いたいと考えている。

这项研究旨在创建α1G基因条件敲除小鼠，以阐明低阈值钙通道α1G在小脑功能中的作用。去年，使用两种经过同源重组的ES细胞克隆产生嵌合小鼠，但任何克隆的嵌合小鼠均未显示ES细胞传播到该种系。今年，去年产生的靶向载体的同源重组区域被2 kb扩展，并在ES细胞中再次克隆同源重组。结果，可以克隆经过同源重组的ES细胞有大约1％的机会。当使用克隆的ES细胞注入小鼠胚泡中时，现在已经创建了具有高ES细胞贡献率的嵌合小鼠。将来，我们计划将这种嵌合小鼠与野生型小鼠越过，以产生异质小鼠。此外，为了特别缺乏α1g基因，在珀kinje细胞中也制备了表达CRE重组酶的转基因小鼠的载体。将来，将使用该载体产生转基因小鼠，并与上述异质小鼠一起繁殖。此外，由于没有具有α1G亚基的高滴度特异性的抗体，因此在大肠杆菌中合成了α1G细胞内环区域作为抗原蛋白，并使用兔子制备多克隆抗体。制备和纯化的抗体特异性识别了一个260 kDa带，该抗体被认为是小脑提取物中的α1G亚基，这是Western blot方法。将来，我们希望在分析小鼠的分析中有效地使用它。