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小脳特異的な低域値型カルシウムチャネルノックアウトマウスの作製と機能解析

小脑特异性低阈值钙通道敲除小鼠的产生及功能分析

基本信息

批准号：
13878165
负责人：
狩野方伸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、低閾値型カルシウムチャネルα1Gの小脳機能における役割を明らかにするため、α1G遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの作製を目的としている。昨年度、相同組み換えを生じた2種のES細胞クローンを用いて、キメラマウスの作製を行ったが、どのクローン由来のキメラマウスも生殖系列へのES細胞伝達を示さなかった。今年度は、昨年作製したターゲッティングベクターの相同組み換え領域を2kb延長して、再度ES細胞で相同組み換え体をクローニングした。その結果、おおよそ1%の確率で相同組み替えを生じたES細胞がクローニングできた。クローニングしたES細胞を用いて、マウス胚盤胞へのインジェクションを行ったところ、現在、ES細胞の寄与率の高いキメラマウスが誕生している。今後はこのキメラマウスを野生型マウスと交配してヘテロマウスを作製する予定である。さらに、小脳プルキンエ細胞特異的にα1G遺伝子を欠損させるため、プルキンエ細胞特異的にCre組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウスのベクターの作製も行った。今後は、このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作出し、上記のヘテロマウスと交配させる予定である。さらにα1Gサブユニット特異的な力価の高い抗体が存在しないため、α1G細胞内ループ領域を抗原タンパクとして大腸菌で合成し、ウサギを用いてポリクローナル抗体の作製を行った。作製し精製した抗体は、Western blot法により小脳抽出物中のα1Gサブユニットだと考えられる260kDaのバンドを特異的に認識した。今後は、ノックアウトマウスの解析に有効に使いたいと考えている。

The purpose of this study is to investigate the low threshold value of α1G in the small cell function, and to investigate the mechanism of α1G in the small cell function. In the past year, the same group of ES cells have been produced, and the ES cells have been produced in the same way. This year, the same group of ES cells was extended to 2kb in the same group of ES cells. The results show that the accuracy rate of 1% is the same as that of ES cells. ES cells are used for reproduction, reproduction and reproduction, and the reproduction rate of ES cells is high. In the future, it will be determined by the wild type. In addition, the cell specific α1G gene is deficient in the production of Cre group enzyme. In the future, we will make a decision on whether to use the right method to make a decision on the right method. In addition, high-level antibodies specific for α1G support exist, and the antigen in the intracellular domain of α1G is synthesized by Escherichia coli, which can be used to support the production of polyclonal antibodies. Preparation and purification of the antibody, Western blot analysis of α1G protein in the extract, and detection of α 260kDa protein in the extract. In the future, there will be no problem in analyzing it.