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ORC4変異マウスを用いた個体レベルでの細胞周期研究

使用 ORC4 突变小鼠进行个体水平的细胞周期研究

基本信息

批准号：
15657045
负责人：
浅野雅秀
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年までにOrigin Recognition Complex (ORC)を構成するサブユニットの1つであるOrc4変異マウスが胎生4.5日目以降にアポトーシスを起こして致死となることを明らかにしたが、今年度はホモ変異胚をレスキューするためにloxP配列で挟んだOrc4遺伝子を導入したトランスジェニック(Tg)マウスの作出を行った。Orc4 cDNAをloxP配列で挟み、マーカー遺伝子としてInternal Ribosomal Entry Siteの制御下にGFPが発現するようにしたOrc4-GFPベクターを作製した。プロモーターにはCAGプロモーターとPGKプロモーターを用いた。まず、HeLa細胞およびNIH3T3細胞に導入して、GFPが発現することを確認した。次に、PGKプロモーター制御下にOrc4が発現するベクターを用いてTgマウスの作出を試みた結果、現在のところ2系統のTgマウスの作出に成功したが、内在性Orc4遺伝子のホモ変異マウスをレスキューするものは得られなかった。導入遺伝子由来のOrc4の発現を成体の臓器別に調べた結果、脳、小腸、筋肉、胸腺、脾臓、精巣では強い発現が確認できたが、心臓、肺、肝臓では弱い発現しか認められず、腎臓ではほとんど発現が認められなかった。内在性のOrc4はこれらの臓器においてほぼ同じレベルで発現していることから、ホモ変異マウスが生存できないのは導入遺伝子の発現が弱いためと考えられた。そこで、さらにTgマウスを作成すると共に、初期胚では導入遺伝子由来のOrc4の発現が十分であり、胚性幹細胞が樹立できる可能性があるので、ホモ変異胚の内部細胞塊培養を試みているところである。Orc4ホモ変異胚性幹細胞が樹立できれば、Creの発現によりOrc4を人為的に欠損させて、細胞周期やDNA複製におけるOrc4の役割を詳細に解析することができる。

Last year, Origin Recognition Complex (ORC) was formed, and the ORC4 gene was introduced into the ORC system. The ORC4 gene was introduced into the ORC system, and the ORC4 gene was introduced into the ORC system. Orc4 cDNA is inserted into the genome, and the GFP gene is expressed under the control of Internal Ribosomal Entry Site. CAG The expression of GFP in HeLa cells and NIH 3T3 cells was confirmed. Second, the PGK is used to control the occurrence of the Orc4, and the Tg is used to make the test result. Now, the Tg of the Orc4 is used to make the test result. The origin of the introduced gene and the occurrence of Orc4 in the adult organs are regulated as a result, and the strong occurrence of Orc4 in the intestine, muscle, thymus, spleen and sperm is confirmed. The weak occurrence of Orc4 in the heart, lung and liver is recognized. The kidney is recognized. Inherent Orc4 is the same as the original Orc4. It is the same as the original Orc 4. The original Orc 4 is the same as the original Orc 4. The original Orc 4 is the same as the original Orc 4. The original Orc 4 is the same as the original Orc 4. The development of embryonic stem cells and the possibility of establishing embryonic stem cells are discussed. Orc4 heteroembryonic stem cells are established, Cre is developed, Orc4 is artificially damaged, cell cycle and DNA replication are analyzed in detail.