使用改进的基因捕获方法分离和功能分析新型发育调控基因-猫眼课题宝

使用改进的基因捕获方法分离和功能分析新型发育调控基因

批准号：

13045014

负责人：

浅野雅秀

金额：

$1.98万

依托单位：

Kanazawa University

依托单位国家：

日本

项目类别：

Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)

财政年份：

2001

资助国家：

日本

项目状态：

已结题

起止时间：

2001 至 --

来源：

https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13045014/

关键词：

遺伝子トラップ発生制御転写因子原腸陥入中胚葉誘導アデノウイルスベクター

中文摘要

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英文摘要

遺伝子トラップは,トラップされる遺伝子の焦点を絞ることが難しいという欠点があったので,我々はレチノイン酸などの液性因子をES細胞に作用させるスクリーニングを工夫してきた。この方法で受容体型のチロシンキナーゼであるEphA2遺伝子のトラップに成功し,その変異マウスの解析からEphA2が尾部の脊索形成に重要な働きをしていることを明らかにした、本研究では更に改良を加えて,アデノウイルスベクターを用いて転写因子をES細胞で発現させることで,発生制御転与因子によって発現調節される遺伝子をトラップすることを試みる.本年度はトラップベクターの改良とアデノウイルスベクターの構築を行った。まず,トラップベクターであるが,以前より我々はSorianoらが開発したレトロウイルストラップベクターを用いていたが,遺伝子をトラップした後にトラップベクターを除去してレスキュー実験ができるように,(Cre-1oxPシステムを導入して改良を行った。次に発生制御転写因子としてBrachyury, HNF-3β,Pax-1を用いることにし,これらを強発現するアデノウイルスベクターをCOS-TPC法により作製した。これらの転写因子を大量に発現させると293細胞に対して毒性が見られたので,293細胞でベクターを増殖する時には挿入した転写因子遺伝子が発現しないように,1oxPで挟んだスタッファーをプロモーターの下流に入れたアデノウイルスベクターを用いることで作製に成功した。このアデノウイルスベクターを細胞に感染させる時に,同時にCreを発現させることによって,転写因子遺伝子の発現が誘導されることをノーザンとウエスタンで確認することができた。現在,レトロウイルストラップベクターをES細胞に感染させて,トラップクローンを大量に単離し,構築したアデノウイルスベクターをそれらに感染させることによって,発生制御転写因子によって発現がコントロールされているトラップ遺伝子の探索を行っている.

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