膜電位センサーを持たないATP受容体チャネルP2X2の膜電位依存的構造変化の解析

分析不具有膜电位传感器的 ATP 受体通道 P2X2 的膜电位依赖性结构变化

基本信息

批准号：
09F09350
负责人：
久保義弘
金额：
$ 1.47万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09F09350/
关键词：
生理学神経科学生体分子蛋白質シグナル伝達

项目摘要

ATP受容体チャネルP2X2は、細胞外ATPの結合により活性化される受容体型イオンチャネルである。ホモ3量体で構成され、1つのサブユニットは2つの膜貫通部位を持つ。その膜貫通部位には、膜電位センサーと考えられる電荷を持つアミノ酸残基のクラスター等は存在しない。しかし、P2X2チャネルは、膜電位依存的活性化を示す。我々は、P2X2チャネルの、リガンドである細胞外ATP結合による活性化、膜電位依存的活性化に伴う、構造変化を捉えることを目指し、研究を進めている。これまでの我々の点変異体D315Aを用いた研究により、ATPの結合部位とゲーティングがおこる膜貫通領域をつなぐリンカー領域は、活性化シグナルの伝播に重要な役割を果たすことが明らかになっている。そこで、活性化に伴い構造変化がおこると考えられるD315Aの近傍にCys残基を導入し、Cys修飾剤による修飾を、電流の変化する速さとして捉えることにより、Cys修飾剤の近寄りやすさ、すなわち、活性化に伴う構造変化を捉える実験を行った。その結果、まず、ATP非存在下よりも、ATP存在下の方が、電流の変化、すなわち修飾の速度が速いことが明らかになった。次に、ATPが存在し続ける状態で、過分極電位と脱分極電位での電流の変化の速度を比較したところ、過分極電位で速いことが明らかになった。すなわち、ATPの結合によって、構造変化が起こるのみならず、膜電位の変化によっても、確かにリンカー領域で構造変化が起こることが明らかになった。この結果は、ATP受容体が膜電位依存性チャネルの側面を有することを、構造変化の側面から捉えたものである。

ATP受体通道P2X2是一种受体型离子通道，通过细胞外ATP的结合而激活。它由同二聚体组成，一个亚基具有两个跨膜位点。没有氨基酸残基簇，这些氨基酸残基被认为是跨膜部位的膜电势传感器。但是，P2X2通道表现出膜电位依赖性激活。我们正在进行研究，目的是通过配体细胞外ATP结合和膜电位依赖性激活来捕获与P2X2通道激活相关的结构变化。先前使用点突变体D315A的研究表明，将ATP结合位点与门控跨膜区域连接的接头区域在激活信号的传播中起着重要作用。因此，我们引入了D315A附近的CYS残基，其中认为结构变化是随着激活而发生的，并且通过将CYS修饰符视为电流变化的速度的修饰，我们进行了一个实验，以捕获接近CYS修饰符的易度性，即与激活相关的结构变化。结果首先表明，在ATP存在下，当前的变化（即修改）比没有ATP的变化要快。接下来，当比较在ATP继续存在的状态下超极化电势和去极化电位处的电流变化速率时，发现它在超极化电位上的速度更快。也就是说，已经揭示了不仅是由于ATP结合而发生的结构变化，而且还会由于膜电位变化而发生结构变化。该结果表明，从结构变化的方面，ATP受体具有膜电压依赖性通道方面。