イオンチヤネル・受容体群の「膜上直接相互作用」によるシナプス伝達の調節機構

离子通道与受体“直接膜相互作用”调节突触传递机制

基本信息

  • 批准号:
    17024058
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.6万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2005
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2005 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

我々は、ATP受容体チャネルP2X_2のポアのイオン選択性等の性質が、細胞膜上での発現密度に依存して劇的に変化することを先に報告した。この知見は、発現状況とATPに依存してP2X_2受容体チャネルに著しい構造変化が起こることを示唆するが、現時点でP2X_2受容体チャネルの構造は全く明らかにされていない。P2X_2の構造とその状況依存的変化を知るというゴールに向けて、我々は、P2X_2蛋白のレコンビナント精製と単一粒子構造解析を行った。まず、P2X_2のN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトを作成し、ツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的解析により、正常な機能を持つことを確認した。その後、cDNAをバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞Sf9に感染させ、免疫細胞化学的に細胞膜上での蛋白発現を確認した。大量スケールでの感染Sf9細胞を回収し、膜画分を50mM dodecyl-beta-maltosideを含む溶液で可溶化し、FLAG抗体を含むゲルによりアフィニティ精製した。SDS-PAGEの銀染色により単一のmajor bandを確認した後、ゲル濾過により精製した。その精製産物を用い、グルタルアルデヒドで架橋後、non-denatureゲルにて電気泳動したところ、主たるバンドのサイズからP2X_2蛋白が3量体であることが示された。さらに、ATP投与後、同様な実験を行うと3量体のバンドが上方にシフトした。このシフトは、GTPやアデノシンの投与や、架橋後のATP投与によっては見られなかったため、リガンド結合により、易動度が変わるような構造変化が起こることが示唆された。精製産物のピーク分画を用い、酢酸ウランにより負染色して電顕撮影したところ、単一蛋白粒子像が観察された。単粒子構造解析の手法により、P2X_2蛋白が3量体であることが確認され、また、大きな細胞外領域を持つ逆ピラミッド状の構造をしていることが明らかになった。
I 々 は, ATP, let body チ ャ ネ ル P2X_2 の ポ ア の イ オ ン sentaku が の properties such as, membrane で の に 発 now density dependent し て drama に variations change す る こ と を に report first し た. こ の knowledge は, 発 now と に ATP dependent し て P2X_2 by let body チ ャ ネ ル に the し い structure - the が up こ る こ と を in stopping す る が, current で P2X_2 by let body チ ャ ネ ル の tectonic は く Ming all ら か に さ れ て い な い. P2X_2 の tectonic と そ の state dependent variations of を know る と い う ゴ ー ル に to け て, I 々 は, P2X_2 protein の レ コ ン ビ ナ ン ト refined と 単 a particle structure line を っ た. ま ず, P2X_2 の N - も し く は C - end に FLAG tag を plus し た コ ン ス ト ラ ク ト を し, consummate ツ メ ガ エ ル oocytes を with い た electric 気 physiology parsing に よ り, normal な function を つ こ と を confirm し た. , after そ の cDNA を バ キ ュ ロ ウ イ ル ス ベ ク タ ー に group み 込 み, insect Sf9 cells に infection さ せ, immunocytochemistry に membrane で の protein 発 を now confirm し た. Large ス ケ ー ル で の infection Sf9 cells を back 収 し, membrane draw points を 50 mm dodecyl - beta - maltoside を solution containing む で solubilization し, FLAG antibody を む ゲ ル に よ り ア フ ィ ニ テ ィ refined し た. SDS-PAGE <s:1> silver staining によ 単 単 one major bandを confirmation <s:1> た followed by ゲ によ filtration によ and <s:1> refinement た. そ の を い, refined products グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド で after the bridge, the non - denature ゲ ル に て electric 気 swimming し た と こ ろ, main た る バ ン ド の サ イ ズ か ら P2X_2 protein が 3 quantity body で あ る こ と が shown さ れ た. Youdaoplaceholder0, after ATP throw, the same な experiment を line うと3 volume <s:1> バ ドが ドが above ドが にシフト た た た. こ の シ フ ト は, GTP や made ア デ ノ シ ン の with や, after bridge の ATP shots and に よ っ て は see ら れ な か っ た た め, リ ガ ン ド combining に よ り, easy mobility が - わ る よ う な structure - the が up こ る こ と が in stopping さ れ た. Refined product の ピ ー ク points draw を い, boggy acid ウ ラ ン に よ り negative staining し て electric 顕 pinch of shadow し た と こ ろ, 単 a protein particles like が 観 examine さ れ た. 単 particle structure の gimmick に よ り, P2X_2 protein が 3 quantity body で あ る こ と が confirm さ れ, ま た, big き な extracellular domain を hold つ inverse ピ ラ ミ ッ ド shape の tectonic を し て い る こ と が Ming ら か に な っ た.

项目成果

期刊论文数量(6)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
OPA1 expression in the normal rat retina and optic nerve
  • DOI:
    10.1002/cne.20586
  • 发表时间:
    2005-07-18
  • 期刊:
  • 影响因子:
    2.5
  • 作者:
    Ju, WK;Misaka, T;Bossy-Wetzel, E
  • 通讯作者:
    Bossy-Wetzel, E
Functional roles of charged amino acid residues on the wall of the cytoplasmic pore of Kir2.1
  • DOI:
    10.1085/jgp.200509434
  • 发表时间:
    2006-04-01
  • 期刊:
  • 影响因子:
    3.8
  • 作者:
    Fujiwara, Y;Kubo, Y
  • 通讯作者:
    Kubo, Y
Protein kinase C shifts the voltage dependence of KCNQ/M channels expressed in Xenopus oocytes
  • DOI:
    10.1113/jphysiol.2005.094995
  • 发表时间:
    2005-11-15
  • 期刊:
  • 影响因子:
    5.5
  • 作者:
    Nakajo, K;Kubo, Y
  • 通讯作者:
    Kubo, Y
Dual signaling is differentially activated by different active states of the metabotropic glutamate receptor1a.
代谢型谷氨酸受体 1a 的不同活性状态会不同地激活双重信号传导。
Visualization of the trimeric P2X2 receptor with a crown-capped extracellular domain
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久保 義弘其他文献

TRPA1チャネルはカフェインにより活性化される
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  • 通讯作者:
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電位感受性ボスファターゼCi-VSPの酵素活性の脱分極側での計測
电压敏感型磷酸酶 Ci-VSP 去极化侧酶活性的测定
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  • 通讯作者:
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孤儿代谢型受体 Prrt3 前脑特异性敲除小鼠的行为分析及其配体的小分子库筛选
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  • 发表时间:
    2017
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  • 作者:
    陳 以珊;山本 友美;周 麗;夏目 里恵;今野 幸太郎 ;上杉 志成;渡辺 雅彦;高雄 啓三;宮川 剛;崎村建司;久保 義弘
  • 通讯作者:
    久保 義弘
哺乳類メラノプシンが持つ分子特性
哺乳动物黑视蛋白的分子特性
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    塚本 寿夫;David Farrens;久保 義弘;小柳 光正;寺北 明久;古谷 祐詞
  • 通讯作者:
    古谷 祐詞

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  • DOI:
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  • 发表时间:
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  • 作者:
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  • 通讯作者:
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    2010
  • 资助金额:
    $ 1.6万
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  • 批准号:
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  • 财政年份:
    2009
  • 资助金额:
    $ 1.6万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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  • 批准号:
    21792041
  • 财政年份:
    2009
  • 资助金额:
    $ 1.6万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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作者:{{ showInfoDetail.author }}

知道了