イオンチヤネル・受容体群の「膜上直接相互作用」によるシナプス伝達の調節機構

离子通道与受体“直接膜相互作用”调节突触传递机制

基本信息

批准号：
17024058
负责人：
久保義弘
金额：
$ 1.6万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17024058/
关键词：
P2X2チャネル ATP受容体発現密度動的構造変化 FRET解析

项目摘要

我々は、ATP受容体チャネルP2X_2のポアのイオン選択性等の性質が、細胞膜上での発現密度に依存して劇的に変化することを先に報告した。この知見は、発現状況とATPに依存してP2X_2受容体チャネルに著しい構造変化が起こることを示唆するが、現時点でP2X_2受容体チャネルの構造は全く明らかにされていない。P2X_2の構造とその状況依存的変化を知るというゴールに向けて、我々は、P2X_2蛋白のレコンビナント精製と単一粒子構造解析を行った。まず、P2X_2のN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトを作成し、ツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的解析により、正常な機能を持つことを確認した。その後、cDNAをバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞Sf9に感染させ、免疫細胞化学的に細胞膜上での蛋白発現を確認した。大量スケールでの感染Sf9細胞を回収し、膜画分を50mM dodecyl-beta-maltosideを含む溶液で可溶化し、FLAG抗体を含むゲルによりアフィニティ精製した。SDS-PAGEの銀染色により単一のmajor bandを確認した後、ゲル濾過により精製した。その精製産物を用い、グルタルアルデヒドで架橋後、non-denatureゲルにて電気泳動したところ、主たるバンドのサイズからP2X_2蛋白が3量体であることが示された。さらに、ATP投与後、同様な実験を行うと3量体のバンドが上方にシフトした。このシフトは、GTPやアデノシンの投与や、架橋後のATP投与によっては見られなかったため、リガンド結合により、易動度が変わるような構造変化が起こることが示唆された。精製産物のピーク分画を用い、酢酸ウランにより負染色して電顕撮影したところ、単一蛋白粒子像が観察された。単粒子構造解析の手法により、P2X_2蛋白が3量体であることが確認され、また、大きな細胞外領域を持つ逆ピラミッド状の構造をしていることが明らかになった。

我们先前报道说，根据细胞膜上表达的密度，ATP受体通道P2X_2孔的离子选择性和其他特性发生了巨大变化。这一发现表明，根据表达状态和ATP，P2X_2受体通道中发生了显着的结构变化，但目前尚未显示P2X_2受体通道的结构。为了了解P2X_2的结构及其上下文依赖性变化，我们对P2X_2蛋白质和单个粒子结构分析进行了重组纯化。首先，创建了一个构建体，其中将标志标签添加到P2X_2的N或C端，并使用异爪蟾卵母细胞进行电生理分析证实，它具有正常的功能。之后，将cDNA掺入杆状病毒载体中，并用SF9感染昆虫细胞，并在细胞膜上进行免疫细胞化学确认的蛋白质表达。收集大规模感染的SF9细胞，将膜级分溶解在含有50 mM十字准-beta-maltoside的溶液中，并在含有FLAG抗体的凝胶上纯化。通过SDS-PAGE的银色染色证实了一个主要谱带，然后通过凝胶过滤纯化。将纯化的产物与戊二醛交联，然后在非降低凝胶上电泳，主带的尺寸显示P2X_2蛋白是三聚体。此外，在ATP给药后，进行了类似的实验，以向上移动三聚体。通过给药GTP或腺苷或交联ATP时，没有观察到这种转移，这表明配体结合会导致结构性变化，从而改变迁移率。当使用纯化产物的峰值级数（用乙酸铀染色并进行电子显微照片）时，观察到单个蛋白质颗粒图像。一种单颗粒结构分析的方法证实了P2X_2蛋白是一种三聚体，并且还表明它具有倒数的锥体结构，具有较大的细胞外区域。