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イオンチヤネル・受容体群の「膜上直接相互作用」によるシナプス伝達の調節機構

离子通道与受体“直接膜相互作用”调节突触传递机制

基本信息

批准号：
17024058
负责人：
久保義弘
金额：
$ 1.6万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17024058/
关键词：
P2X2チャネル ATP受容体発現密度動的構造変化 FRET解析

项目摘要

我々は、ATP受容体チャネルP2X_2のポアのイオン選択性等の性質が、細胞膜上での発現密度に依存して劇的に変化することを先に報告した。この知見は、発現状況とATPに依存してP2X_2受容体チャネルに著しい構造変化が起こることを示唆するが、現時点でP2X_2受容体チャネルの構造は全く明らかにされていない。P2X_2の構造とその状況依存的変化を知るというゴールに向けて、我々は、P2X_2蛋白のレコンビナント精製と単一粒子構造解析を行った。まず、P2X_2のN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトを作成し、ツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的解析により、正常な機能を持つことを確認した。その後、cDNAをバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞Sf9に感染させ、免疫細胞化学的に細胞膜上での蛋白発現を確認した。大量スケールでの感染Sf9細胞を回収し、膜画分を50mM dodecyl-beta-maltosideを含む溶液で可溶化し、FLAG抗体を含むゲルによりアフィニティ精製した。SDS-PAGEの銀染色により単一のmajor bandを確認した後、ゲル濾過により精製した。その精製産物を用い、グルタルアルデヒドで架橋後、non-denatureゲルにて電気泳動したところ、主たるバンドのサイズからP2X_2蛋白が3量体であることが示された。さらに、ATP投与後、同様な実験を行うと3量体のバンドが上方にシフトした。このシフトは、GTPやアデノシンの投与や、架橋後のATP投与によっては見られなかったため、リガンド結合により、易動度が変わるような構造変化が起こることが示唆された。精製産物のピーク分画を用い、酢酸ウランにより負染色して電顕撮影したところ、単一蛋白粒子像が観察された。単粒子構造解析の手法により、P2X_2蛋白が3量体であることが確認され、また、大きな細胞外領域を持つ逆ピラミッド状の構造をしていることが明らかになった。

I 々は, ATP, let body チャネル P2X_2 のポアのイオン sentaku がの properties such as, membrane でのに発 now density dependent して drama に variations change することをに report first した. この knowledge は, 発 now とに ATP dependent して P2X_2 by let body チャネルに the しい structure - the が up こることを in stopping するが, current で P2X_2 by let body チャネルの tectonic はく Ming all らかにされていない. P2X_2 の tectonic とその state dependent variations of を know るというゴールに to けて, I 々は, P2X_2 protein のレコンビナント refined と単 a particle structure line をった. まず, P2X_2 の N - もしくは C - end に FLAG tag を plus したコンストラクトをし, consummate ツメガエル oocytes を with いた electric 気 physiology parsing により, normal な function をつことを confirm した. , after その cDNA をバキュロウイルスベクターに group み込み, insect Sf9 cells に infection させ, immunocytochemistry に membrane での protein 発を now confirm した. Large スケールでの infection Sf9 cells を back 収し, membrane draw points を 50 mm dodecyl - beta - maltoside を solution containing むで solubilization し, FLAG antibody をむゲルによりアフィニティ refined した. SDS-PAGE <s:1> silver staining によ単単 one major bandを confirmation <s:1> た followed by ゲによ filtration によ and <s:1> refinement た. そのをい, refined products グルタルアルデヒドで after the bridge, the non - denature ゲルにて electric 気 swimming したところ, main たるバンドのサイズから P2X_2 protein が 3 quantity body であることが shown された. Youdaoplaceholder0, after ATP throw, the same な experiment を line うと3 volume <s:1> バドがドが above ドがにシフトたたた. このシフトは, GTP や made アデノシンの with や, after bridge の ATP shots and によっては see られなかったため, リガンド combining により, easy mobility が - わるような structure - the が up こることが in stopping された. Refined product のピーク points draw をい, boggy acid ウランにより negative staining して electric 顕 pinch of shadow したところ, 単 a protein particles like が観 examine された. 単 particle structure の gimmick により, P2X_2 protein が 3 quantity body であることが confirm され, また, big きな extracellular domain を hold つ inverse ピラミッド shape の tectonic をしていることが Ming らかになった.