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イオンチヤネル・受容体群の「膜上直接相互作用」によるシナプス伝達の調節機構

离子通道与受体“直接膜相互作用”调节突触传递机制

基本信息

批准号：
17024058
负责人：
久保義弘
金额：
$ 1.6万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17024058/
关键词：
P2X2チャネル ATP受容体発現密度動的構造変化 FRET解析

项目摘要

我々は、ATP受容体チャネルP2X_2のポアのイオン選択性等の性質が、細胞膜上での発現密度に依存して劇的に変化することを先に報告した。この知見は、発現状況とATPに依存してP2X_2受容体チャネルに著しい構造変化が起こることを示唆するが、現時点でP2X_2受容体チャネルの構造は全く明らかにされていない。P2X_2の構造とその状況依存的変化を知るというゴールに向けて、我々は、P2X_2蛋白のレコンビナント精製と単一粒子構造解析を行った。まず、P2X_2のN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトを作成し、ツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的解析により、正常な機能を持つことを確認した。その後、cDNAをバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞Sf9に感染させ、免疫細胞化学的に細胞膜上での蛋白発現を確認した。大量スケールでの感染Sf9細胞を回収し、膜画分を50mM dodecyl-beta-maltosideを含む溶液で可溶化し、FLAG抗体を含むゲルによりアフィニティ精製した。SDS-PAGEの銀染色により単一のmajor bandを確認した後、ゲル濾過により精製した。その精製産物を用い、グルタルアルデヒドで架橋後、non-denatureゲルにて電気泳動したところ、主たるバンドのサイズからP2X_2蛋白が3量体であることが示された。さらに、ATP投与後、同様な実験を行うと3量体のバンドが上方にシフトした。このシフトは、GTPやアデノシンの投与や、架橋後のATP投与によっては見られなかったため、リガンド結合により、易動度が変わるような構造変化が起こることが示唆された。精製産物のピーク分画を用い、酢酸ウランにより負染色して電顕撮影したところ、単一蛋白粒子像が観察された。単粒子構造解析の手法により、P2X_2蛋白が3量体であることが確認され、また、大きな細胞外領域を持つ逆ピラミッド状の構造をしていることが明らかになった。

We report in advance the properties of ATP receptor P2X2, such as its selectivity and the dependence of its occurrence density on cell membrane. This knowledge is dependent on ATP and the occurrence status of P2X_2 receptor. The structure of P2X_2 receptor is completely different from that of P2X_2 receptor. P2X_2 protein structure and condition-dependent transformation are known and analyzed in detail. P2X_2 protein structure is refined and analyzed in detail. P2X_2 N-terminal FLAG tag is added to the oocyte to create, analyze and confirm the normal function of oocytes. The expression of protein on the cell membrane of insect cells Sf9 was confirmed by immunocytochemistry. A large number of infected Sf9 cells were recovered, membrane fractions were solubilized by 50mM dodecyl-beta-maltoside, and FLAG antibodies were purified by 50 mM dodecyl-beta-maltoside SDS-PAGE silver staining was performed to confirm the major band and to refine it. P2X2 protein was purified from the protein by the following three methods: bridging, non-denature, electrokinetic, and electrokinetic methods. After the ATP is cast, the same is true for the first time. The structure of the bridge is changed by the structure of the bridge, and the bridge is changed by the structure of the bridge. The purified product was separated by a medium and an acid. The negative staining was performed by electrophotography. The protein particle image was observed. P2X_2 protein has been identified in three dimensional structures in the extracellular domain.