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膜電位-細胞長変換素子プレスチンの分子構築と動的構造変化

膜电位-细胞长度转换元件prestin的分子构建及动态结构变化

基本信息

批准号：
18059033
负责人：
久保義弘
金额：
$ 6.21万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18059033/
关键词：
生理学神経科学生体分子蛋白質シグナル伝達

项目摘要

今年度、以下の成果を得た。(1)プレスチンに結合する蛋白分子を同定する目的で、yeastを用いたtwo hybrid法による検索を行った。プレスチンが内耳の外遊毛細胞に強く発現していることを念頭において、脳全体ではなく、蝸牛器官から微量のpolyA(+)RNAを抽出し、cDNAライブラリーを作成した。スクリーニングの結果、いくつかの候補分子を同定した。(2)単粒子構造解析を目指し、Baculo virus Sf9細胞発現系を用いてFLAG tagを付加したプレスチン全蛋白を発現させ、その膜画分をdodecyl beta-maltosideを用いて可溶化し、FLAG affinity columnおよび、ゲルろ過カラムを用いて精製した。ゲルろ過の結果、および、非変性ゲル電気泳動の結果から、4量体であることが示された。最終精製蛋白を、酢酸ウランによる負染色の後に電顕撮影し、得られた13,000個の画像データを元に、種々の角度から見た平均2次元画像の取得と3次元投射画像の再構築を行った。最終的に、4方対称の77x77x115Aの弾丸状の構造をしていること、抗体の結合位置から、弾尻が細胞内側に位置することが明らかになった。(3)C末端細胞内領域に蛍光蛋白CFPもしくはYFPを付加したコンストラクトを共発現させ、FRET解析を行った。Bathに高K+液を投与することにより細胞を脱分極させたところ、FRETの減少が観察された。

This year, the following results were achieved. (1)The two hybrid methods were used to determine the molecular structure of the protein. In addition, in the inner ear, the outer hair cells are strongly expressed, and in the whole body, in the snail organs, trace amounts of polyA(+)RNA are extracted, and cDNA is produced. The result of the search is the same as the candidate molecule. (2)Single particle structure analysis: Baculo virus Sf9 cell development system: FLAG tag: full protein development: membrane component: dodecyl beta-maltoside: solubilization: FLAG affinity column: purification: purification: The results of the electromigration are as follows: Finally, after the negative staining of protein and acid, 13,000 images were obtained, and the average 2D image was obtained. The final, four-sided, 77 x 77 x 115 A, pill-shaped structure is located in the middle of the cell, and the binding position of the antibody is located in the inner part of the cell. (3)C The terminal intracellular domain of CFP was analyzed by fluorescence microscopy and FRET analysis. Bath high K+ solution to the cell separation, FRET reduction