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膜電位-細胞長変換素子プレスチンの分子構築と動的構造変化

膜电位-细胞长度转换元件prestin的分子构建及动态结构变化

基本信息

批准号：
18059033
负责人：
久保義弘
金额：
$ 6.21万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18059033/
关键词：
生理学神経科学生体分子蛋白質シグナル伝達

项目摘要

今年度、以下の成果を得た。(1)プレスチンに結合する蛋白分子を同定する目的で、yeastを用いたtwo hybrid法による検索を行った。プレスチンが内耳の外遊毛細胞に強く発現していることを念頭において、脳全体ではなく、蝸牛器官から微量のpolyA(+)RNAを抽出し、cDNAライブラリーを作成した。スクリーニングの結果、いくつかの候補分子を同定した。(2)単粒子構造解析を目指し、Baculo virus Sf9細胞発現系を用いてFLAG tagを付加したプレスチン全蛋白を発現させ、その膜画分をdodecyl beta-maltosideを用いて可溶化し、FLAG affinity columnおよび、ゲルろ過カラムを用いて精製した。ゲルろ過の結果、および、非変性ゲル電気泳動の結果から、4量体であることが示された。最終精製蛋白を、酢酸ウランによる負染色の後に電顕撮影し、得られた13,000個の画像データを元に、種々の角度から見た平均2次元画像の取得と3次元投射画像の再構築を行った。最終的に、4方対称の77x77x115Aの弾丸状の構造をしていること、抗体の結合位置から、弾尻が細胞内側に位置することが明らかになった。(3)C末端細胞内領域に蛍光蛋白CFPもしくはYFPを付加したコンストラクトを共発現させ、FRET解析を行った。Bathに高K+液を投与することにより細胞を脱分極させたところ、FRETの減少が観察された。

This year, the following "achievements". The main results were as follows: (1) the protein molecule was used to determine the same purpose, and yeast was used to determine the target gene by two hybrid method. The outer hair cells of the inner ear strongly show that the hair cells of the inner ear are divided into four parts: the whole body, the bovine organs, the trace amount of polyA (+), the RNA extract, and the cDNA extract. Please check the results and the candidate molecules are the same. (2) Particle production and analysis. Baculo virus Sf9 cell assay is used to analyze the content of total protein by FLAG tag. The whole protein is detected by dodecyl beta-maltoside, and the membrane is separated by solubility, FLAG affinity column, and filtration. The results of the exercise, the results of the exercise and the results of the exercise. After the most refined protein and soralic acid were stained, the video clips were made by computer, and 13000 portraits were obtained, and the average 2-dimensional portraits were obtained with an average of 2-dimensional projection portraits. The most expensive and four square cubes are called 77x77x115A pills to make a pill, an antibody binding site, a rump, an intracellular position, a clear knot, a pill. (3) the intracellular domain of the C-terminal region, the CFP protein, the YFP, the YFP, the intracellular domain, the light protein, the light protein, the YFP, the light protein, the light protein, the light The high K+ concentration of Bath was significantly higher than that of FRET, and there was no significant difference between high K+ and high K+ liquid.