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膜電位-細胞長変換素子プレスチンの分子構築と動的構造変化

膜電位-細胞長変換素子プレスチンの分子構築と動的構造変化
膜电位-细胞长度转换元件prestin的分子构建及动态结构变化
批准号：
18059033
负责人：
久保 義弘
金额：
$6.21万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
项目状态：
已结题
起止时间：
2006 至 2007
来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18059033/
关键词：
生理学神経科学生体分子蛋白質シグナル伝達

项目摘要

项目成果

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今年度、以下の成果を得た。(1)プレスチンに結合する蛋白分子を同定する目的で、yeastを用いたtwo hybrid法による検索を行った。プレスチンが内耳の外遊毛細胞に強く発現していることを念頭において、脳全体ではなく、蝸牛器官から微量のpolyA(+)RNAを抽出し、cDNAライブラリーを作成した。スクリーニングの結果、いくつかの候補分子を同定した。(2)単粒子構造解析を目指し、Baculo virus Sf9細胞発現系を用いてFLAG tagを付加したプレスチン全蛋白を発現させ、その膜画分をdodecyl beta-maltosideを用いて可溶化し、FLAG affinity columnおよび、ゲルろ過カラムを用いて精製した。ゲルろ過の結果、および、非変性ゲル電気泳動の結果から、4量体であることが示された。最終精製蛋白を、酢酸ウランによる負染色の後に電顕撮影し、得られた13,000個の画像データを元に、種々の角度から見た平均2次元画像の取得と3次元投射画像の再構築を行った。最終的に、4方対称の77x77x115Aの弾丸状の構造をしていること、抗体の結合位置から、弾尻が細胞内側に位置することが明らかになった。(3)C末端細胞内領域に蛍光蛋白CFPもしくはYFPを付加したコンストラクトを共発現させ、FRET解析を行った。Bathに高K+液を投与することにより細胞を脱分極させたところ、FRETの減少が観察された。
期刊论文(6)
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会议论文
Regulation of the desensitization and ion selectivity of ATP-gated P2X2 channels by phosphoinositides
DOI： 10.1113/jphysiol.2006.115246
发表时间： 2006-10-01
期刊： JOURNAL OF PHYSIOLOGY-LONDON
影响因子： 5.5
作者： [Fujiwara, Yuichiro, Kubo, Yoshihiro]
通讯作者： Kubo, Yoshihiro
KCNE1 and KCNE3 Stabilize and/or Slow Vbltage Sensing S4 Segment of KCNQ1 Channel.
KCNE1 和 KCNE3 稳定和/或慢速检测 KCNQ1 通道的 S4 段。
DOI： --
发表时间： 2007
期刊： Journal of General Physiology 130
影响因子： --
作者： [Onoda, T., et. al., Nakajo K and Kubo Y]
通讯作者： Nakajo K and Kubo Y
Functional roles of charged amino acid residues on the wall of the cytoplasmic pore of Kir2.1
DOI： 10.1085/jgp.200509434
发表时间： 2006-04-01
期刊： JOURNAL OF GENERAL PHYSIOLOGY
影响因子： 3.8
作者： [Fujiwara, Y, Kubo, Y]
通讯作者： Kubo, Y
Coupling profile of the metabotropic glutamate receptor 1□is regulated by the C-terminal domain.
代谢型谷氨酸受体1□的偶联特征由C端结构域调节。
DOI： --
发表时间： 2007
期刊： Molecular and Cellular Neuroscience 34
影响因子： --
作者： [Tateyama M, Kubo Y]
通讯作者： Kubo Y
共 6 条
    チャネルにおけるイオン透過と非典型的膜電位依存性ゲーティングのカップリングの検証
    チャネルにおけるイオン透過と非典型的膜電位依存性ゲーティングのカップリングの検証
    膜電位センサーを持たないATP受容体チャネルP2X2の膜電位依存的構造変化の解析
    TRPA1チャネルのカフェインに対する応答の質的種間差異に基づく活性化機構の解明
    海外基金