クロマチン構造変換モニタリングシステムの開発

【目的】本研究はクロマチンリモデリングに対する視覚的なモニター系の開発を試みるものである。具体的には、我々が見出した滑膜肉腫細胞の原因遺伝子SYT-SSXとSWI/SNF型クロマチンリモデリング因子hBRMとの結合(Nagai,et al.PNAS,2001)に基づき系の確立を試みる。【方法と結果】(i)予備実験として、SYT-SSXが原因であるHuman Synovial sarcoma細胞株SYO-1においてFRETプローブが機能することを確認した。SYO-1細胞にRac活性のモニタリングプローブを導入し、HGFで刺激することで、効率にFRET(蛍光共鳴エネルギー移行)反応が誘導されることを確認した。(ii)本研究においてはSYT-SSXとhBRMが結合することに基づいて、CFP-SYT-SSXとYFP-hBRM(140-180AA)を共発現させて、2分子FRETの検出を試みたが、ノイズが多く有意な差は得られなかった。現在、SYT-SSXの構造変化に基づく、2分子FRETのプローブを作成中であり、現在有意なシグナルの検出を試みている。(iii)また、本研究においてはSYT-SSXのクロマチンリモデリング機能を解析する過程において、SYT-SSXは細胞に導入するとp21の発現を誘導しsenescenceを見出した(Tsuda, M.,et al.,Oncogene,2005)。さらにこの現象はp53非依存性であり、Sp-1依存性であることが判明した。SYT-SSXはhBRMを介してクロマチンリモデリングを誘導するので、以上の結果を利用して、SYT-SSXまたはhBRMとSp-1との2分子でのFRETプローブの開発を検討する。

【目的】本研究はクロマチンリモデリングに対する視覚的なモニター系の開発を試みるものである。具体的には、我々が見出した滑膜肉腫細胞の原因遺伝子SYT-SSXとSWI/SNF型クロマチンリモデリング因子hBRMとの結合(Nagai,et al.PNAS,2001)に基づき系の確立を試みる。【方法と結果】(i)予備実験として、SYT-SSXが原因であるHuman Synovial sarcoma細胞株SYO-1においてFRETプローブが機能することを確認した。SYO-1細胞にRac活性のモニタリングプローブを導入し、HGFで刺激することで、効率にFRET(蛍光共鳴エネルギー移行)反応が誘導されることを確認した。(ii)本研究においてはSYT-SSXとhBRMが結合することに基づいて、CFP-SYT-SSXとYFP-hBRM(140-180AA)を共発現させて、2分子FRETの検出を試みたが、ノイズが多く有意な差は得られなかった。現在、SYT-SSXの構造変化に基づく、2分子FRETのプローブを作成中であり、現在有意なシグナルの検出を試みている。(iii)また、本研究においてはSYT-SSXのクロマチンリモデリング機能を解析する過程において、SYT-SSXは細胞に導入するとp21の発現を誘導しsenescenceを見出した(Tsuda, M.,et al.,Oncogene,2005)。さらにこの現象はp53非依存性であり、Sp-1依存性であることが判明した。SYT-SSXはhBRMを介してクロマチンリモデリングを誘導するので、以上の結果を利用して、SYT-SSXまたはhBRMとSp-1との2分子でのFRETプローブの開発を検討する。