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新たな遺伝子発現抑制法を用いた難治性疼痛発症機序解明(遺伝子治療に向けて)

使用新的基因表达抑制方法阐明顽固性疼痛的发病机制（走向基因治疗）

基本信息

批准号：
16659421
负责人：
真下節
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659421/
关键词：
siRNA 遺伝子発現抑制 In vitro in vivo

项目摘要

16年度In vitro実験系でノックダウンが確認(報告)されたsiRNA(Qiagen : Control Library siRNA)をin vivo神経系に導入するべく、ポジティブコントロールにmouse MAPK1 siRNAを、ネガティブコントロールにnegative control siRNAを採用した。17年度siRNAの投与は様々な濃度(最高3μmol/3μL)を用いて脊髄くも膜下腔内投与を行い、組織取りだしは投与後12時間から72時間の間で行ったが、ノックダウンの確認はできなかった。ノックダウン成否の確認には、脊髄腰膨大部組織よりRNA(5μg)を抽出し、MAPK1の発現をリアルタイムRT-PCRにて行った。さらに脊髄凍結切片から脊髄後角組織を顕微鏡下に微少抽出(レーザーマイグロダイセクション法)して同様にRT-PCR法を用いて発現の変化を検討した。脊髄くも膜下腔内投与でノックダウンが確認できなかったので現在は脊髄に直接注入する方法を検討した。さらに、吸入麻酔下に脊椎椎弓切除をして脊髄を露出し、33G針を用いてマイクロインジェクションする方法を考案した。染色液を用いて脊髄投与法を検証し、麻酔覚醒後の運動神経、疼痛行動の変化も併せて観察した。

In 2016, the In vitro laboratory confirmed (reported) that siRNA(Qiagen : Control Library siRNA) was introduced into the vivo nervous system, mouse MAPK1 siRNA was developed, and negative control siRNA was adopted in Nebuchtendoro. In 17 years, siRNA was administered at a concentration of up to 3μmol/3μL in the submembranous cavity, and tissue samples were taken from 12 to 72 hours after administration. RNA(5μg) was extracted and MAPK1 was detected by RT-PCR. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method was used to detect the changes in the dorsal horn tissue of the spinal cord. The method of direct injection into the membrane is discussed. In addition, the method of removing the vertebral arch under inhalation anesthesia to expose the spinal cord and using a 33G needle to make a surgical procedure was studied. The staining solution is used to detect the movement of the spinal cord and the method of anesthesia, and to detect the movement of the spinal cord and pain.