新たな遺伝子発現抑制法を用いた難治性疼痛発症機序解明(遺伝子治療に向けて)

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16年度In vitro実験系でノックダウンが確認(報告)されたsiRNA(Qiagen : Control Library siRNA)をin vivo神経系に導入するべく、ポジティブコントロールにmouse MAPK1 siRNAを、ネガティブコントロールにnegative control siRNAを採用した。17年度siRNAの投与は様々な濃度(最高3μmol/3μL)を用いて脊髄くも膜下腔内投与を行い、組織取りだしは投与後12時間から72時間の間で行ったが、ノックダウンの確認はできなかった。ノックダウン成否の確認には、脊髄腰膨大部組織よりRNA(5μg)を抽出し、MAPK1の発現をリアルタイムRT-PCRにて行った。さらに脊髄凍結切片から脊髄後角組織を顕微鏡下に微少抽出(レーザーマイグロダイセクション法)して同様にRT-PCR法を用いて発現の変化を検討した。脊髄くも膜下腔内投与でノックダウンが確認できなかったので現在は脊髄に直接注入する方法を検討した。さらに、吸入麻酔下に脊椎椎弓切除をして脊髄を露出し、33G針を用いてマイクロインジェクションする方法を考案した。染色液を用いて脊髄投与法を検証し、麻酔覚醒後の運動神経、疼痛行動の変化も併せて観察した。