マルチプルアミンセンサの開発

コリネ型土壌細菌Arthrobacter globiformis由来のヒスタミンオキシダーゼ(HAO)はトパキノンを補酵素とする銅含有酵素ファミリーの一つで、ヒスタミンを基質とする。我々はこれまでに本酵素を固定化し西洋ワサビペルオキシダーゼを含むオスミウムゲルを電子媒体として、電気化学的にヒスタミンを検出するヒスタミンセンサーを考案、実用化させできた。HAOはすでにクローニング済みで、さらにHis-tag付のHAOを得ている。大腸菌から発現精製した本酵素を用いて以下の検討を行った。1)HAOの生化学的性質の検討と基質チャネル改変アミンオキシダーゼの検討:HPLC-ECD法を用いてHAOの基質特異性を検討した結果、ヒスタミン、代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン、生体内には存在しないN^π-メチルヒスタミンに対し活性比はそれぞれ100、75、117%であった。大腸菌から発現精製した本酵素の結晶化を進めている。また愛媛大学総合科学研究支援センターに設置されている無細胞系タンパク質自動合成装置を用いて変異酵素の作成とスクリーニングを進めている。2)ヒスタミン、メチルヒスタミンの測定系の開発:ヒスタミン(HA)とその代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン(N^τ-MHA)をo-フタルアルデヒド、亜硫酸イオンと反応させプレカラム誘導体化によるHPLC-電気化学的(ECD)検出法を新規に開発し、生体サンプルへの応用を検討した。HA、N^τ-MHAさらに内部標準としてN^π-メチルヒスタミン(N^π-MHA)をo-フタルアルデヒド、亜硫酸ナトリウムとアルカリ条件下で反応させ、反応物をHPLC(ODSカラム)にて分離溶出し、電気化学検出法にて検出した。HA、N^π-MHA、N^τ-MHAはそれぞれ14.2、16.5、23.3分に溶出され検出感度は1pmolであった。マウス脳HA、N^τ-MHA含量はそれぞれ0.60、0.48nmol/gであった。

コリネ型土壌細菌Arthrobacter globiformis由来のヒスタミンオキシダーゼ(HAO)はトパキノンを補酵素とする銅含有酵素ファミリーの一つで、ヒスタミンを基質とする。我々はこれまでに本酵素を固定化し西洋ワサビペルオキシダーゼを含むオスミウムゲルを電子媒体として、電気化学的にヒスタミンを検出するヒスタミンセンサーを考案、実用化させできた。HAOはすでにクローニング済みで、さらにHis-tag付のHAOを得ている。大腸菌から発現精製した本酵素を用いて以下の検討を行った。1)HAOの生化学的性質の検討と基質チャネル改変アミンオキシダーゼの検討:HPLC-ECD法を用いてHAOの基質特異性を検討した結果、ヒスタミン、代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン、生体内には存在しないN^π-メチルヒスタミンに対し活性比はそれぞれ100、75、117%であった。大腸菌から発現精製した本酵素の結晶化を進めている。また愛媛大学総合科学研究支援センターに設置されている無細胞系タンパク質自動合成装置を用いて変異酵素の作成とスクリーニングを進めている。2)ヒスタミン、メチルヒスタミンの測定系の開発:ヒスタミン(HA)とその代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン(N^τ-MHA)をo-フタルアルデヒド、亜硫酸イオンと反応させプレカラム誘導体化によるHPLC-電気化学的(ECD)検出法を新規に開発し、生体サンプルへの応用を検討した。HA、N^τ-MHAさらに内部標準としてN^π-メチルヒスタミン(N^π-MHA)をo-フタルアルデヒド、亜硫酸ナトリウムとアルカリ条件下で反応させ、反応物をHPLC(ODSカラム)にて分離溶出し、電気化学検出法にて検出した。HA、N^π-MHA、N^τ-MHAはそれぞれ14.2、16.5、23.3分に溶出され検出感度は1pmolであった。マウス脳HA、N^τ-MHA含量はそれぞれ0.60、0.48nmol/gであった。