膜透過型細胞内ループを用いたGPCRのGタンパク質活性化機構解明

使用膜渗透性细胞内环阐明 GPCR 的 G 蛋白激活机制

• 批准号: 17651125
• 负责人: 松崎 勝巳
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17651125/
• 关键词: GPCR; 細胞内ループ; 膜透過性; アルキル化; 抗菌性ペプチド; 膜透過ペプチド

マウスプロスタグランジンEP3β受容体(mEP3β)の第1〜第3細胞内ループ(i1〜i3)およびC末端尾部のペプチドのN末端をパルミトイル化し、膜透過型に改変することによって、Gタンパク質の直接活性化を試みた。まず、これら4種のペプチドをFmoc固相法で合成し、mEP3β発現CHO細胞に10μMの濃度で加え、スルプロストーンによる細胞内cAMP量の増加に対する抑制活性を再評価した。パルミチン酸のみ(コントロール)およびパルミトイル化i1〜i3では、cAMP量がわずかに(10-20%)減少したのみであったが、パルミトイル化C末では、50%減少し、アゴニスト様の活性が観察された。そこで、パルミトイル化C末をリポソームと様々な比率で混合し、トリプトファン蛍光を測定したところ、濃度依存的にブルーシフトが観察され、膜上での会合が示唆された。これに対し、パルミトイル化i2ではこのような変化は観測されなかったことから、パルミトイル化C末の会合がアゴニスト活性に関与していることが示唆された。また、ループペプチドの膜透過性向上のため、抗菌性ペプチドタキプレシンを用いる可能性についても検討した。タキプレシンIのN末端に分子量約5000のポリエチレングリコール(PEG)をペプチドモデルとして結合させたPEG-タキプレシンIを合成した。NBDラベルした多重層リポソームとジチオナイトを用いた実験から、PEG-タキプレシンIもタキプレシンI同様、膜透過性を有していることが明らかとなった。以上のように,膜透過塑ループペプチドはGPCRのGタンパグ質活性化機構解明に有用であることが明らかとなった.

マ ウ ス プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン EP3 beta by let body (beta) mEP3 の within 1 ~ 3 cells ル ー プ (i1 ~ i3) お よ び C at the end of the tail の ペ プ チ ド の N terminal を パ ル ミ ト イ ル し, membrane type through に change - す る こ と に よ っ て, G タ ン パ ク qualitative の directly activeness を try み た. ま ず, こ れ ら four の ペ プ チ ド を Fmoc solid-phase method で synthesis し, mEP3 beta 発 now CHO cells に 10 microns の concentration で え, ス ル プ ロ ス ト ー ン に よ る intracellular cAMP in の raised add に す seaborne る inhibitory activity を again review 価 し た. パ ル ミ チ ン acid の み (コ ン ト ロ ー ル) お よ び パ ル ミ ト イ ル the i1 ~ i3 で は, cAMP が わ ず か に (10-20%) decrease し た の み で あ っ た が, パ ル ミ ト イ ル change at the end of the C で は, 50% reduce し, ア ゴ ニ ス ト others の active が 観 examine さ れ た. そ こ で, パ ル ミ ト イ ル change at the end of the C を リ ポ ソ ー ム と others 々 な ratio で mixed し, ト リ プ ト フ ァ ン 蛍 light を determination し た と こ ろ, concentration dependent に ブ ル ー シ フ ト が 観 examine さ れ, membrane で meet の が in stopping さ れ た. こ れ に し, seaborne パ ル ミ ト イ ル the i2 で は こ の よ う な variations change は 観 measuring さ れ な か っ た こ と か ら, パ ル ミ ト イ ル meet at the end of the C の が ア ゴ ニ ス ト active に masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た. ま た, ル ー プ ペ プ チ ド の membrane permeability upward の た め, antibacterial ペ プ チ ド タ キ プ レ シ ン を with い る possibility に つ い て も beg し 検 た. タ キ プ レ シ ン の I N terminal に molecular weight about 5000 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル (PEG) を ペ プ チ ド モ デ ル と し て combining さ せ た PEG - タ キ プ レ シ ン I を synthetic し た. NBD ラ ベ ル し た multiple layer リ ポ ソ ー ム と ジ チ オ ナ イ ト を with い た be 験 か ら, PEG - タ キ プ レ シ ン I も タ キ プ レ シ ン I with others, membrane permeability を し て い る こ と が Ming ら か と な っ た. Above の よ う に, membrane through the plastic ル ー プ ペ プ チ ド は GPCR の G タ ン パ グ qualitative activeness agencies interpret に useful で あ る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

Action mechanism of tachyplesin I and effects of PEGylation

• DOI: 10.1016/j.bbamem.2007.01.005
• 发表时间: 2007-05-01
• 期刊: BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOMEMBRANES
• 影响因子: 3.4
• 作者: Imura, Yuichi;Nishida, Minoru;Matsuzaki, Katsumi
• 通讯作者: Matsuzaki, Katsumi