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膜透過型細胞内ループを用いたGPCRのGタンパク質活性化機構解明

使用膜渗透性细胞内环阐明 GPCR 的 G 蛋白激活机制

基本信息

批准号：
17651125
负责人：
松崎勝巳
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

マウスプロスタグランジンEP3β受容体(mEP3β)の第1〜第3細胞内ループ(i1〜i3)およびC末端尾部のペプチドのN末端をパルミトイル化し、膜透過型に改変することによって、Gタンパク質の直接活性化を試みた。まず、これら4種のペプチドをFmoc固相法で合成し、mEP3β発現CHO細胞に10μMの濃度で加え、スルプロストーンによる細胞内cAMP量の増加に対する抑制活性を再評価した。パルミチン酸のみ(コントロール)およびパルミトイル化i1〜i3では、cAMP量がわずかに(10-20%)減少したのみであったが、パルミトイル化C末では、50%減少し、アゴニスト様の活性が観察された。そこで、パルミトイル化C末をリポソームと様々な比率で混合し、トリプトファン蛍光を測定したところ、濃度依存的にブルーシフトが観察され、膜上での会合が示唆された。これに対し、パルミトイル化i2ではこのような変化は観測されなかったことから、パルミトイル化C末の会合がアゴニスト活性に関与していることが示唆された。また、ループペプチドの膜透過性向上のため、抗菌性ペプチドタキプレシンを用いる可能性についても検討した。タキプレシンIのN末端に分子量約5000のポリエチレングリコール(PEG)をペプチドモデルとして結合させたPEG-タキプレシンIを合成した。NBDラベルした多重層リポソームとジチオナイトを用いた実験から、PEG-タキプレシンIもタキプレシンI同様、膜透過性を有していることが明らかとなった。以上のように,膜透過塑ループペプチドはGPCRのGタンパグ質活性化機構解明に有用であることが明らかとなった.

The first to third intracellular positions (i1 ~ i3) and the N-terminal position of the C-terminal tail of the EP3 β receptor (mEP3 β) were tested for direct activation of the membrane-permeable receptor. The inhibitory activity of mEP3 β produced in CHO cells by Fmoc solid-phase synthesis of these four species was evaluated in response to the increase in intracellular cAMP at 10μM concentration.パルミチン酸のみ(コントロール)およびパルミトイル化i1〜i3では、cAMP量がわずかに(10-20%)减少したのみであったが、パルミトイル化C末では、50%减少し、アゴニスト様の活性が観察された。For example, if the concentration of a compound is higher than the concentration of a compound, the concentration of the compound is higher than the concentration of the compound. This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with someone who's been in a relationship with someone else. The possibility of using the membrane permeability and antibacterial properties of the membrane is discussed. The N-terminal component of PEG-I is about 5000. NBD multi-layer separation system, PEG-100% separation system, membrane permeability The above is useful for understanding the mechanism of GPCR activation through membrane permeation.