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FRETとFRAPによる脂溶性リガンド分子と受容体結合の可視化と分子相関解析

通过 FRET 和 FRAP 进行脂溶性配体分子与受体结合的可视化和分子相关分析

基本信息

批准号：
17659057
负责人：
河田光博
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究課題では、ステロイドホルモンをはじめとする脂溶性リガンド分子の化学的蛍光標識を行い、受容体との分子相関をリアルタイムで可視化した。エストラジオールとアンドロゲンの誘導体であるジヒドロテストステロンを、リンカーを介してOH基に低分子蛍光物質BODYPY-TMあるいはAlexa 546を化学的に標識させた。蛍光標識されたこれらの脂溶性シグナル分子を、エストロゲンレセプター(ERα/b)、アンドロゲンレセプター(AR)、のプラスミドをトランスフェクションさせた培養細胞にマイクロインジェクション法で注入、あるいはジギトニン処理したセミインタクト細胞の培養液に添加した。各種培養細胞(内因性受容体を有しない細胞や内因性受容体を有する細胞)にこれらの受容体融合遺伝子を導入してタンパクの発現を行わせ、リガンド添加による蛍光像の変化を共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss LSM-510META)、CCDカメラ設置蛍光顕微鏡を用いて観察した。受容体を強制発現させた細胞において、培養液中に標識エストロゲンを添加すると、標識リガンドは核に集積することが判明した。次に、非標識Alexa標識のエストロゲンと非標識エストロゲンをセミインタクト細胞に作用させたが、標識エストロゲンの核内での存在を認めなかった。一方、膜受容体であるとされるGPR30の細胞内分布を検索したところ、ゴルジ装置や疎面小胞体に一致してその分布が見られ、海馬神経細胞や視床下部オキシトシンニューロンに特異的な局在を認めた。これらから、膜結合型受容体の脳内での働きの解明に示唆を与える結果が得られ、in vitro, in vivoでの膜受容体と核受容体のコンバージェンスが示唆された。

This research topic is about the visualization of lipid soluble molecules and their molecular correlations. The chemical identification of BODY-TM, a low molecular weight fluorescent substance, is carried out by the reaction medium Alexa 546. The lipid soluble molecules of the light marker are injected into the culture medium of the cultured cells, and the lipid soluble molecules are added into the culture medium of the cultured cells. Various kinds of cultured cells (endogenous receptor cells and endogenous receptor cells) are introduced into the host cell fusion gene, and the host cell fusion gene fusion Cell culture medium, identification medium, secondary, non-labeled Alexa logo The intracellular distribution of GPR30 in the hippocampus and membrane receptors is consistent with that in the lower part of the optic bed. The membrane and nuclear receptors in vitro, in vivo, were found to be the most sensitive and sensitive to radiation.