シヤペロンによる再構築されたプロテアソームの構造機能解析

分子シャペロンhsp90αを用いて、任意の細胞抽出液より26Sプロテアソームをin vitro構築することが可能である事を明らかにし、その構造及び機能の解析を行った。その結果以下の事が明らかになった。1、ヒスチジンタグ-hsp90αをATP存在下の細胞抽出液に加えイミダゾールで回収する事により、26Sプロテアソーム及びハイブリッドプロテアソームが得られた。これらのプロテアソームは特異的基質であるsuc-LLVY-amcを加水分解した。またこの分子複合体は、hsp90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシン処理により構造が破壊された。即ち、これらのプロテアソームの構築とその維持にhsp90αが重要な役割を果たしていることが推察された。2、ヒスチジンタグ-hsp90αをATP非存在下の細胞抽出液に加える事により、hsp90α-20Sプロテアソームを構築する事ができた。このプロテアソーム複合体は、特異的基質であるsuc-LLVY-amcに対する加水分解活性を示さないが、MHCクラスIペプチドをフランキングを含む合成ペプチドから切り出す事ができた。また、この分子複合体の中には、hsc70,hsp40,p23,CHIPなどのシャペロン或はコシャペロン分子が会合していた。この分子複合体をさらにATP処理するとhsp40,p23,CHIPは遊離し最後にhsp90α/hsc70/20Sのみからなる複合体が得られた。hsp90α/hsc70/20Sは同様に合成ペプチドを切断する事ができた。一方、シャペロンの会合しない20Sのみの構造ではMHCクラスIペプチドを切り出す事は出来なかった。この結果は新規のプロテアソームの存在を示唆するが、生理学的にそのような構造のプロテアソームが細胞内に存在するか否かについてはさらなる検討が必要と考えられた。

分子シャペロンhsp90αを用いて、任意の細胞抽出液より26Sプロテアソームをin vitro構築することが可能である事を明らかにし、その構造及び機能の解析を行った。その結果以下の事が明らかになった。1、ヒスチジンタグ-hsp90αをATP存在下の細胞抽出液に加えイミダゾールで回収する事により、26Sプロテアソーム及びハイブリッドプロテアソームが得られた。これらのプロテアソームは特異的基質であるsuc-LLVY-amcを加水分解した。またこの分子複合体は、hsp90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシン処理により構造が破壊された。即ち、これらのプロテアソームの構築とその維持にhsp90αが重要な役割を果たしていることが推察された。2、ヒスチジンタグ-hsp90αをATP非存在下の細胞抽出液に加える事により、hsp90α-20Sプロテアソームを構築する事ができた。このプロテアソーム複合体は、特異的基質であるsuc-LLVY-amcに対する加水分解活性を示さないが、MHCクラスIペプチドをフランキングを含む合成ペプチドから切り出す事ができた。また、この分子複合体の中には、hsc70,hsp40,p23,CHIPなどのシャペロン或はコシャペロン分子が会合していた。この分子複合体をさらにATP処理するとhsp40,p23,CHIPは遊離し最後にhsp90α/hsc70/20Sのみからなる複合体が得られた。hsp90α/hsc70/20Sは同様に合成ペプチドを切断する事ができた。一方、シャペロンの会合しない20Sのみの構造ではMHCクラスIペプチドを切り出す事は出来なかった。この結果は新規のプロテアソームの存在を示唆するが、生理学的にそのような構造のプロテアソームが細胞内に存在するか否かについてはさらなる検討が必要と考えられた。