トランスポゾンを用いたニワトリ胚細胞の半永久的遺伝子操作

使用转座子对鸡胚胎细胞进行半永久性遗传操作

基本信息

批准号：
18657070
负责人：
高橋淑子
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

トリ胚を用いたエレクトロポレーション法は、さまざまな遺伝子を目的とする組織に導入する方法として極めて有効である。しかしながら、従来のエレクトロポレーション法の問題として、導入された遺伝子の発現が2〜3日間しか維持されないことであった。これは導入された遺伝子が核内染色体に組み込まれないために、細胞の増殖に伴って遺伝子コピー数が減少し、やがては消失してしまうことが原因と考えられていた。我々はこれまでに、これらの問題を克服するために、小型魚類で用いられているTol2トランスポゾン法をトリ胚エレクトロポレーション法に応用し、導入遺伝子をトリゲノム内に安定的に組み込むことに成功している。今年度はさらにこの方法を改良し、我々が最近トリ胚で確立したTet-on法とを組み合わせ、ゲノム上に安定的に組み込まれた外来遺伝子の発現時期を人工的にコントロールできる手法を確立した。準備したplasmidは以下の通り:1)目的とする遺伝子(たとえばEGFP)をTRE(Tetracycline-responsive element)によってドライブさせ、さらにこれらの発現カセットをTol2vectorに組み込んだplasmid。2)rtTA-M2(Dox依存的にTREに結合して転写を活性化させる因子をコードする)を組み込んだTol2vector。3)Tol2vector上の遺伝子カセットがゲノムに組み込まれるために必要なトランスポゼースを発現させるCAGGS-TP。これら3種のplasmidを、エレクトロポレーション法を用いてトリ胚内に共同入し、さらに3日後にDoxを注入すると、EGFPの発現が開始された。これらの新規の方法を用いると、これまで不可能であった胚発生の後期過程におこる器官形成における遺伝子の機能の解析が可能となる。

使用鸟类胚胎的电穿孔非常有效，作为将各种基因引入其预期的组织的方法。但是，常规电穿孔方法的问题是，引入基因的表达仅维持2-3天。这被认为是因为引入的基因未整合到核染色体中，导致基因拷贝数量随着细胞的增殖而减少，并最终消失。为了克服这些问题，我们成功地应用了用于小鱼的TOL2转座子方法，将其用于鸟类胚胎电穿孔方法，并稳定地将转基因掺入三角体中。今年，我们进一步改进了这种方法，将其与我们最近在鸟类胚胎中建立的Tet-ON方法相结合，并建立了一种允许人为地控制稳定整合到基因组中的外源基因表达时间的方法。制备的质粒如下：1）靶基因（例如，EGFP）由TRE驱动（Tetracycline-响应元件），并且这些表达盒掺入了TOL21vector中。 2）TOL2VECTOR融合了RTTA-M2（编码以DOX依赖性方式结合TRE并激活转录的因素）。 3）CAGGS-TP表达了将基因盒在TOL2ACTOCTOR上纳入基因组所需的转座酶。使用电穿孔将这三个质粒共注射到禽类胚胎中，并在3天后注入DOX以启动EGFP表达。使用这些新型方法，可以分析在胚胎发育晚期发生的器官发生中基因的功能，这是以前不可能的。