臓器の酸化ストレスを予知する血清検査法の開発

制限酵素で断片化したゲノムDNAを用いて、特定の修飾塩基を含む断片を特異的に免疫沈降する方法の開発を行った。酸化ストレスにより生成する修飾塩基として、8-hydroxy(oxo)guanine, acrolein-modified adenine, thymine glycolを選出し、それぞれ特異性を確認したモノクローナル抗体を使用した。二本鎖オリゴDNAで修飾塩基をひとつ含む断片を作成し、システムが稼働することを確認した。次に制限酵素で切断したゲノムDNAを使用し、負荷DNA量・修飾塩基の含量と正の量依存性があることを確認した。マウスに鉄キレート化合物を投与し、酸化ストレス傷害を起こした腎臓を使用して以下の実験を行った。対照として、未処置動物腎臓を使用し、ゲノムに存在する8-hydroxyguanineの除去修復を行う酵素OGG1のノックアウト動物も使用した。酸化ストレスを与えると、免疫沈降されたDNA断片量は8-hydroxyguanine, acrolein-modified adenineに関して有意に増加した。回収DNA断片をライブラリーとみなしてクローニングし、未処置コントロール群と酸化ストレス群の両修飾塩基について、各群約300クローンの塩基配列決定を行い、データベースで染色体上の位置を確認し、マッピングを行った。染色体分布に関して検討すると、各群において有意に高頻度・低頻度を示す染色体が存在した。特に、8-hydroxyguanine/controlで多い16番染色体とacrolein-modifiedadenine/oxidative stressで多い15番染色体に注目した。ペインティング・プローブを使用してFISH解析を行うと、15番は核膜の近傍に、16番は核中心部に存在する確率の高いことが判明した。また、ヒト線維芽細胞を使用し紫外線を照射する系においても、thymine glycolに関して同様の方法論の有効性を確認した。また、本法の応用として、免疫沈降したDNA断片を増幅し、注目するゲノム領域でPCR解析ができるプロトコールも開発した。結論として、今回検討したDNA修飾塩基のゲノム内分布はランダムではないことが判明し、新たな血清検査法への基礎となるデータを得ることが出来た。

制限酵素で断片化したゲノムDNAを用いて、特定の修飾塩基を含む断片を特異的に免疫沈降する方法の開発を行った。酸化ストレスにより生成する修飾塩基として、8-hydroxy(oxo)guanine, acrolein-modified adenine, thymine glycolを選出し、それぞれ特異性を確認したモノクローナル抗体を使用した。二本鎖オリゴDNAで修飾塩基をひとつ含む断片を作成し、システムが稼働することを確認した。次に制限酵素で切断したゲノムDNAを使用し、負荷DNA量・修飾塩基の含量と正の量依存性があることを確認した。マウスに鉄キレート化合物を投与し、酸化ストレス傷害を起こした腎臓を使用して以下の実験を行った。対照として、未処置動物腎臓を使用し、ゲノムに存在する8-hydroxyguanineの除去修復を行う酵素OGG1のノックアウト動物も使用した。酸化ストレスを与えると、免疫沈降されたDNA断片量は8-hydroxyguanine, acrolein-modified adenineに関して有意に増加した。回収DNA断片をライブラリーとみなしてクローニングし、未処置コントロール群と酸化ストレス群の両修飾塩基について、各群約300クローンの塩基配列決定を行い、データベースで染色体上の位置を確認し、マッピングを行った。染色体分布に関して検討すると、各群において有意に高頻度・低頻度を示す染色体が存在した。特に、8-hydroxyguanine/controlで多い16番染色体とacrolein-modifiedadenine/oxidative stressで多い15番染色体に注目した。ペインティング・プローブを使用してFISH解析を行うと、15番は核膜の近傍に、16番は核中心部に存在する確率の高いことが判明した。また、ヒト線維芽細胞を使用し紫外線を照射する系においても、thymine glycolに関して同様の方法論の有効性を確認した。また、本法の応用として、免疫沈降したDNA断片を増幅し、注目するゲノム領域でPCR解析ができるプロトコールも開発した。結論として、今回検討したDNA修飾塩基のゲノム内分布はランダムではないことが判明し、新たな血清検査法への基礎となるデータを得ることが出来た。