臓器の酸化ストレスを予知する血清検査法の開発

开发预测器官氧化应激的血清测试方法

• 批准号: 18659160
• 负责人: 豊國 伸哉
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659160/
• 关键词: 酸化ストレス; ゲノム; 修飾塩基; モノクローナル抗体; 免疫沈降法; 染色体領域; 免疫沈降; 血清検査

制限酵素で断片化したゲノムDNAを用いて、特定の修飾塩基を含む断片を特異的に免疫沈降する方法の開発を行った。酸化ストレスにより生成する修飾塩基として、8-hydroxy(oxo)guanine, acrolein-modified adenine, thymine glycolを選出し、それぞれ特異性を確認したモノクローナル抗体を使用した。二本鎖オリゴDNAで修飾塩基をひとつ含む断片を作成し、システムが稼働することを確認した。次に制限酵素で切断したゲノムDNAを使用し、負荷DNA量・修飾塩基の含量と正の量依存性があることを確認した。マウスに鉄キレート化合物を投与し、酸化ストレス傷害を起こした腎臓を使用して以下の実験を行った。対照として、未処置動物腎臓を使用し、ゲノムに存在する8-hydroxyguanineの除去修復を行う酵素OGG1のノックアウト動物も使用した。酸化ストレスを与えると、免疫沈降されたDNA断片量は8-hydroxyguanine, acrolein-modified adenineに関して有意に増加した。回収DNA断片をライブラリーとみなしてクローニングし、未処置コントロール群と酸化ストレス群の両修飾塩基について、各群約300クローンの塩基配列決定を行い、データベースで染色体上の位置を確認し、マッピングを行った。染色体分布に関して検討すると、各群において有意に高頻度・低頻度を示す染色体が存在した。特に、8-hydroxyguanine/controlで多い16番染色体とacrolein-modifiedadenine/oxidative stressで多い15番染色体に注目した。ペインティング・プローブを使用してFISH解析を行うと、15番は核膜の近傍に、16番は核中心部に存在する確率の高いことが判明した。また、ヒト線維芽細胞を使用し紫外線を照射する系においても、thymine glycolに関して同様の方法論の有効性を確認した。また、本法の応用として、免疫沈降したDNA断片を増幅し、注目するゲノム領域でPCR解析ができるプロトコールも開発した。結論として、今回検討したDNA修飾塩基のゲノム内分布はランダムではないことが判明し、新たな血清検査法への基礎となるデータを得ることが出来た。

Restriction enzymes are used to fragment DNA, and specific modified enzymes are used to fragment DNA, and specific immunoprecipitation methods are used to carry out fragmentation. Acidified ストレスにより generates するmodified oxoyl として, 8-hydroxy(oxo)guanine, acrolein-modified adenine, thymine Glycols are selected, and specific specificity and confirmation of glycol antibodies are used. The second lock of the DNA is modified, the base is broken, and the fragment is made, and the sewage is confirmed. The restriction enzyme is used to cut the DNA, and the amount of DNA loaded and the content of the modified hydroxyl group is determined to be quantitatively dependent. The マウスに鄄キレートcompoundをinvestmentし, acidifiedストレスdamageをriseこしたkidneyⓓをuseしてthe followingの実験を行った.対光として, use of unprocessed animal kidneys, ゲノムに presence of 8-hydroxyguanine, removal and repair of enzyme OGG1, use of animals. Acidification of ストレスを and えると, immunoprecipitation of されたDNA fragment amount は8-hydroxyguanine, acrolein-modified adenine of に关して intentional にincrease plus した. Recover DNA fragments , untreated コントロールgroup and acidified ストレスgroup の両modified chlorine base について, each group of about 300 クローンの塩base arrangement determines を行い, データベースでconfirmation of the position on the chromosome, and マッピングを行った. The distribution of chromosomes is determined by the distribution of chromosomes, and the high frequency and low frequency of each group indicate the presence of chromosomes. Specially, 8-hydroxyguanine/control is used in chromosome 16 and acrolein-modifiedadenine/oxidative stress is used in chromosome 15.ペインティング・プローブをUse してFISH to analyze を行うと、15fanはThe presence of the near side of the nuclear membrane and the central part of the 16th phase of the nucleus can be determined with high accuracy. The validity of the method of using ultraviolet irradiation and thymine glycol is confirmed by using ultraviolet rays and thymine glycol.また, the application of this method, immunoprecipitation, DNA fragmentation, PCR analysis, immunoprecipitation, and PCR analysis. Conclusion: What is the distribution of DNA modifications in the base of the DNA?ことが clarified し, new たな serum check method へ の basic と な る デ ー タ を got る こ と が came out た.

项目成果

Molecular mechanisms of oxidative stress‐induced carcinogenesis: From epidemiology to oxygenomics

• DOI: 10.1002/iub.61
• 发表时间: 2008-07
• 期刊: IUBMB Life
• 影响因子: 4.6
• 作者: S. Toyokuni

Contrasting genome-wide distribution of 8-hydroxyguanine and acrolein-modified adenine during oxidative stess-induced renal carcinogenesis

氧化应激诱导肾癌过程中 8-羟基鸟嘌呤和丙烯醛修饰腺嘌呤的全基因组分布对比

• 发表时间: 2006
• 期刊: The American Journal of Pathology 169/4
• 作者: Liu YT;Shang DH;Akatsuka S;et. al.;Akatsuka S et al.
• 通讯作者: Akatsuka S et al.

DNA免疫沈降法を用いた紫外線によるDNA傷害と修復の解析

使用 DNA 免疫沉淀法分析紫外线诱导的 DNA 损伤和修复

• 发表时间: 2007
• 作者: 吉原美奈子;赤塚慎也;豊國伸哉
• 通讯作者: 豊國伸哉