造血幹細胞と幹細胞ニッチの相互作用における軸索ガイダンス分子の機能の解明

軸索ガイダンス分子の骨髄内における詳細な発現解析を行った。どの軸索ガイダンス分子が骨髄内のどの細胞に発現しているのかを知るためにin situ hybridization法、免疫組織化学ならびにAP in situ法(affinity probe in situ法)を用い、kit(造血幹細胞)、osteocalcin(骨芽細胞)などの各細胞のマーカーと二重染色を行い、各分子の発現分布を明らかにした。これらによりいくつかの分子の骨髄細胞上における特徴的発現様式を認めた。したがって、これらの分子は機能解析実験の候補蛋白となると考え、次の機能実験を行った。in vivo機能アッセイによる軸索ガイダンス分子機能のスクリーニング 造血幹細胞-ニッチ間の接着を司る分子は造血幹細胞の細胞周期を休止させ外的ストレスから幹細胞を守る働きを持つことが示唆されてきた。造血幹細胞に発現の見られるガイダンス分子について、マウスに外的ストレスを加え、ニッチに接着して残存した造血幹細胞に当該ガイダンス分子が発現しているか(当該ガイダンス分子によって残存できた可能性があるのか)を見た。また、当該分子が細胞周期を遅くするのに役立っているかどうかのスクリーニングとして、BrdU long term retaining cellsと当該分子の二重染色を行った。in vitro機能アッセイによる軸索ガイダンス分子機能の再構成 collagen gel assayはgel内にガイダンス分子の濃度勾配を再現しておき、この濃度勾配中に調べる細胞を置いて細胞濃度勾配に誘引されて移動するか、濃度勾配に反発して逆向きに移動するかを見るものである。造血幹細胞を当該ガイダンス分子の濃度勾配中において誘引ないしは反発を観察することによりニッチからの遊走やニッチに向かうhomingの機序をin vitroで検討した。

軸索ガイダンス分子の骨髄内における詳細な発現解析を行った。どの軸索ガイダンス分子が骨髄内のどの細胞に発現しているのかを知るためにin situ hybridization法、免疫組織化学ならびにAP in situ法(affinity probe in situ法)を用い、kit(造血幹細胞)、osteocalcin(骨芽細胞)などの各細胞のマーカーと二重染色を行い、各分子の発現分布を明らかにした。これらによりいくつかの分子の骨髄細胞上における特徴的発現様式を認めた。したがって、これらの分子は機能解析実験の候補蛋白となると考え、次の機能実験を行った。in vivo機能アッセイによる軸索ガイダンス分子機能のスクリーニング 造血幹細胞-ニッチ間の接着を司る分子は造血幹細胞の細胞周期を休止させ外的ストレスから幹細胞を守る働きを持つことが示唆されてきた。造血幹細胞に発現の見られるガイダンス分子について、マウスに外的ストレスを加え、ニッチに接着して残存した造血幹細胞に当該ガイダンス分子が発現しているか(当該ガイダンス分子によって残存できた可能性があるのか)を見た。また、当該分子が細胞周期を遅くするのに役立っているかどうかのスクリーニングとして、BrdU long term retaining cellsと当該分子の二重染色を行った。in vitro機能アッセイによる軸索ガイダンス分子機能の再構成 collagen gel assayはgel内にガイダンス分子の濃度勾配を再現しておき、この濃度勾配中に調べる細胞を置いて細胞濃度勾配に誘引されて移動するか、濃度勾配に反発して逆向きに移動するかを見るものである。造血幹細胞を当該ガイダンス分子の濃度勾配中において誘引ないしは反発を観察することによりニッチからの遊走やニッチに向かうhomingの機序をin vitroで検討した。