Midkine RNA interferance関節内投与による関節炎治療

特定関節に対する関節注射による関節炎治療は整形外科特有で有用な治療法であり、現状でも広く行われている治療である。Midkineは炎症性細胞遊走に関わり、Knock-out mouseを用いた抗体起因性の関節炎モデルでは関節炎が抑制された。又、RA患者では関節液、血清中の濃度が上昇していた。炎症性細胞遊走や血管新生に関わるMidkineの抑制は関節炎症の治療法として有望であると思われる。阻害効果が強いとされるRNA干渉(RNA interference, RNAi)を用いたMidkine抑制による関節炎治療の可能性を検討した。関節内投与による関節炎抑制の目的達成に向けて、比較的不安定と考えられるsiRNAの導入効率について検討した。細胞培養実験でGFPラットから筋細胞、骨髄間葉系細胞、線維細胞を採取して培養、RNAiによるGFP阻害の最適なsiRNAデザインを複数候補決定した。培養細胞では固定標本作成後の蛍光顕微鏡下で観察して、GFP蛍光の消失によりsiRNAが導入されたこと、特に線維芽細胞でのRNAi発生が高率であることが確認できた。これは滑膜組織に導入効率が高い事を示唆する結果であった。複数種のsiRNAカクテルによる抑制を検討し、至適条件の設定に成功した。細胞培養条件での導入効率向上に成功した。更に動物実験での関節投与でsiRNAiの導入効率上昇を目的とした関節注射担体(carrier)の開発に向けた検討を行った。前述のGFP遺伝子に対するsiRNAを作成して、各種の導入方法を試みた。エレクトロポレーション、リポフェクション等と比較してアテロコラーゲンを担体とした場合が優れた導入効率を示した。投入効率評価には蛍光顕微鏡観察によって蛍光を観察することにより行った。更にRNA抽出後ライトサイクラーにて定量的RT-PCRを行い、GFP阻害効果を定量化して、抑制効果の定量化を行った。

特定関節に対する関節注射による関節炎治療は整形外科特有で有用な治療法であり、現状でも広く行われている治療である。Midkineは炎症性細胞遊走に関わり、Knock-out mouseを用いた抗体起因性の関節炎モデルでは関節炎が抑制された。又、RA患者では関節液、血清中の濃度が上昇していた。炎症性細胞遊走や血管新生に関わるMidkineの抑制は関節炎症の治療法として有望であると思われる。阻害効果が強いとされるRNA干渉(RNA interference, RNAi)を用いたMidkine抑制による関節炎治療の可能性を検討した。関節内投与による関節炎抑制の目的達成に向けて、比較的不安定と考えられるsiRNAの導入効率について検討した。細胞培養実験でGFPラットから筋細胞、骨髄間葉系細胞、線維細胞を採取して培養、RNAiによるGFP阻害の最適なsiRNAデザインを複数候補決定した。培養細胞では固定標本作成後の蛍光顕微鏡下で観察して、GFP蛍光の消失によりsiRNAが導入されたこと、特に線維芽細胞でのRNAi発生が高率であることが確認できた。これは滑膜組織に導入効率が高い事を示唆する結果であった。複数種のsiRNAカクテルによる抑制を検討し、至適条件の設定に成功した。細胞培養条件での導入効率向上に成功した。更に動物実験での関節投与でsiRNAiの導入効率上昇を目的とした関節注射担体(carrier)の開発に向けた検討を行った。前述のGFP遺伝子に対するsiRNAを作成して、各種の導入方法を試みた。エレクトロポレーション、リポフェクション等と比較してアテロコラーゲンを担体とした場合が優れた導入効率を示した。投入効率評価には蛍光顕微鏡観察によって蛍光を観察することにより行った。更にRNA抽出後ライトサイクラーにて定量的RT-PCRを行い、GFP阻害効果を定量化して、抑制効果の定量化を行った。