FIB-SEM法を用いた神経回路網の3次元的解析

点击翻译按钮获取中文摘要

神経回路の形態解析の手段として最も解像度の高い方法は電子顕微鏡を用いた解析法である。しかし、電子顕微鏡を用いる解析法は試料作成に時間がかかる事や、手技の習熟が必要である等の難点が有り、近年急速に進歩した共焦点顕微鏡を用いた神経回路のイメージング法に比べて容易に応用できる技術とは言えない状況である。本研究では、電子顕微鏡を用いた形態解析をより簡便にすることを目的とし、試料作成の最も大きな律速段階である連続切片の作製過程を自動化する方法を検討した。本研究では最も簡便な方法としてFocused Ion Beam (FIB)による、試料表面のエッチング法を検討した。FIB gunが走査型電子顕微鏡内に組み込まれたDual Beam FIB-SEM (FEI社)を用い、エポン包埋した試料を連続的にエッチングしてその都度表面像を取得する方法(slice and view)を試みた所、透過型電子顕微鏡で連続切片を検鏡するのに1週間ほどかかった作業が1日でできる事がわかった。しかし、FIBでエッチングできる深さに限界があるため、広い範囲に突起をのばしている神経細胞の形態解析には応用が困難と思われた。また、画像取得に用いる反射電子像は透過電子像や二次電子像に比べると分解能が低いため、細胞内小器官の詳細な構造までは解析する事が困難であった。しかし、シナプスの形態やシナプス小胞の数の解析には充分な分解能を与える事がわかった。これらの結果から、神経回路の形態解析においてFIB-SEM法は、シナプスのような局所の3次元的形態解析を簡便にできる方法であり、共焦点顕微鏡法と組み合わせる事でより詳細な形態解析に威力を発揮するものと考えられる。