遺伝子機能解析を迅速化するための新しい両アレル変異導入法の開発

开发新的双等位基因诱变方法以加速基因功能分析

• 批准号: 19651086
• 负责人: 堀江 恭二
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19651086/
• 关键词: バイオテクノロジー; ES細胞; Bloom; 遺伝子; ゲノム

本研究では、国際プロジェクトとして急速に構築が進んでいる変異ES細胞バンクのリソースを効率的に利用して表現型解析を加速化するために、片アレル変異体(ヘテロ変異体)から両アレル変異体(ホモ変異体)を迅速に誘導する手法の開発を試みた。具体的には、RNAi法を用いてBloom遺伝子の発現を抑制することで、相同染色体間の組換え効率を高め、その結果として両アレル変異体を誘導することを期待した。Nanog遺伝子座の一方のアレルへ単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子をノックインしたES細胞に対して、Bloom遺伝子に対する標的配列を有すRNAi用レトロウイルスベクターを導入した。Bloom遺伝子の発現抑制によりNanog遺伝子座の両アレルが野生型に変換されると、ES細胞がガンシクロビールに耐性になると予想した。しかし、耐性細胞の出現効率の上昇は認められなかった。そこで、相同染色体間組換えに対して、Bloom遺伝子と共同して作用すると報告されている遺伝子に着目し、その遺伝子の活性を、RNAi法を用いてBloom遺伝子とともに抑制することで、ホモ変異体の出現効率を上昇させることを試みた。しかし、RNAi法による効果的な遺伝子発現抑制は困難で、成功には至らなかった。RNAi法での効率的ホモ変異体単離は困難であったことから、我々が以前から用いていた、「テトラサイクリンシステムによるBloom遺伝子発現抑制を介したホモ変異体単離法」のプロトコールを改善することに方向転換し、結果的に、ホモ変異体の迅速な単離が可能となった。また、本研究で開発したRNAiベクターは、ホモ変異体の表現型解析のための一般的手法として役立てることができた。

This study is an attempt to rapidly develop methods for the rapid induction of heterogeneous ES cells by accelerating phenotype analysis and rapid development of heterogeneous ES cells. Specific RNAi methods are used to inhibit the expression of Bloom genes, and the rate of interchromosomal DNA transformation is expected to be high. The target alignment of the Nanog vector is to introduce RNAi into the ES cell. The target alignment of the Bloom vector is to introduce RNAi into the ES cell. Bloom gene expression inhibition is expected to result in the loss of wild-type genes in Nanog gene loci and in the development of ES cell tolerance. The emergence rate of resistant cells increased. For example, if the gene expression level of the same chromosome is higher than that of the same chromosome, the gene expression level of the same chromosome is higher than that of the same chromosome. It is difficult and successful for RNAi methods to suppress the occurrence of genetic defects. The effect of RNAi method is different from that of other methods. The effect of RNAi method is different from that of other methods. The effect of RNAi method is different from that of other methods. This study is aimed at developing a general approach to phenotypic analysis of RNAi.