ランタニド結合配列を用いたエンドソーム・マクロピノソームの可視化

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究の目的は(1)わずか17アミノ酸残基の蛍光標識タグであるランタニド結合タグ(LBT)を用いた細胞生物学研究に適したバイオイメージング技術を確立すること、(2)とくにマクロピノサイトーシスやエンドソームのリサイクル現象を可視化すること、(3)新規のタンパク質細胞内導入ドメイン(PTD)を単離すること、の3点である。これらについて以下の成果を得た。●哺乳動物細胞での遺伝子発現ベクターpCDNA3.1にクローニングされた遺伝子に、LBTタグを付加して培養細胞でのタンパク質の発現を確認した。マクロピノサイトーシス時の細胞骨格の再構成の可視化に向けて、別途GFP-tubulinの安定発現細胞株の樹立を行った。LBTで可視化した別の細胞骨格・エンドソーム関連因子との二重染色の実験は現在進行中である。●ヒトの蛋白質由来の新規PTD配列2種(IGFBP-3/IGFBP-5)を単離同定し、その細胞内導入の経路がHIV-TATと同様のヘパリン依存的マクロピノサイトーシス経路であることを明らかにした(Exp.Cell Res.,314 2352-2361.(2008))。●IGFBP-5由来の新規PTD配列のヘパリン結合時の立体構造を調べた結果、HIV-TATと異なりa-helix構造が誘導されないことが明らかになった。この差がIGFBP由来PTDとHIV-TATの導入速度の差に関連して,いる可能性がある。●京都大学との共同研究を行い、LBT-PTD-二重タグ付きUbが活用して導入効率の向上を検定した。HIV-TAT由来PTDを用いて蛋白質導入を行い、最終的に生きたヒト細胞に15N標識した蛋白質を導入しその多次元NMRを測定するIn-cell NMRP技術の確立に貢献した(Nature458106-109(2009)).これらの研究は、おおむね研究実施計画どおりに進行しており、マクロピノサイトーシスの観察手法としてのLBT蛍光イメージング法はほぼ実用化できた。