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ランタニド結合配列を用いたエンドソーム・マクロピノソームの可視化

使用镧系元素结合序列可视化内体和巨胞质体

基本信息

批准号：
19657048
负责人：
廣明秀一
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は(1)わずか17アミノ酸残基の蛍光標識タグであるランタニド結合タグ(LBT)を用いた細胞生物学研究に適したバイオイメージング技術を確立すること、(2)とくにマクロピノサイトーシスやエンドソームのリサイクル現象を可視化すること、(3)新規のタンパク質細胞内導入ドメイン(PTD)を単離すること、の3点である。これらについて以下の成果を得た。●哺乳動物細胞での遺伝子発現ベクターpCDNA3.1にクローニングされた遺伝子に、LBTタグを付加して培養細胞でのタンパク質の発現を確認した。マクロピノサイトーシス時の細胞骨格の再構成の可視化に向けて、別途GFP-tubulinの安定発現細胞株の樹立を行った。LBTで可視化した別の細胞骨格・エンドソーム関連因子との二重染色の実験は現在進行中である。●ヒトの蛋白質由来の新規PTD配列2種(IGFBP-3/IGFBP-5)を単離同定し、その細胞内導入の経路がHIV-TATと同様のヘパリン依存的マクロピノサイトーシス経路であることを明らかにした(Exp.Cell Res.,314 2352-2361.(2008))。●IGFBP-5由来の新規PTD配列のヘパリン結合時の立体構造を調べた結果、HIV-TATと異なりa-helix構造が誘導されないことが明らかになった。この差がIGFBP由来PTDとHIV-TATの導入速度の差に関連して,いる可能性がある。●京都大学との共同研究を行い、LBT-PTD-二重タグ付きUbが活用して導入効率の向上を検定した。HIV-TAT由来PTDを用いて蛋白質導入を行い、最終的に生きたヒト細胞に15N標識した蛋白質を導入しその多次元NMRを測定するIn-cell NMRP技術の確立に貢献した(Nature458106-109(2009)).これらの研究は、おおむね研究実施計画どおりに進行しており、マクロピノサイトーシスの観察手法としてのLBT蛍光イメージング法はほぼ実用化できた。

The objectives of this study are (1) to establish a new technology for identifying and identifying 17 amino acid residues in cell biology,(2) to visualize the phenomenon of protein transfer,(3) to develop a new method for identifying and identifying protein transfer (PTD) in cells. 3 o'clock. The following results were obtained.● Gene development in mammalian cells pCDNA3.1, gene development in mammalian cells, LBT development in cultured cells The visualization of cytoskeleton reconstruction in the presence of GFP-tubulin and the establishment of stable cell lines LBT visualization of different cytoskeletal cells and correlation factors and double staining are now in progress. The new PTD alignment of protein origin of the two species (IGFBP-3/IGFBP-5) is independent of the same, and the intracellular introduction pathway of HIV-TAT is independent of the same (Exp.Cell Res., 314 2352-2361. (2008))。●IGFBP-5 is derived from the new PTD arrangement and the three-dimensional structure of the combination is adjusted. The HIV-TAT and a-helix structure are induced. The difference between IGFBP and PTD is related to the difference between HIV-TAT and the speed of introduction.● Kyoto University's joint research, LBT-PTD-double shift Ub to use the introduction of efficiency and upward adjustment HIV-TAT contributes to the establishment of the In-cell NMRP technique for protein introduction into cells and the determination of protein in cells using PTD (Nature458106-109(2009)). The research and implementation plan of the project is carried out in a timely manner, and the investigation method of the project is carried out in a timely manner.