生細胞でのリン酸化反応の可視化技術の開発

活细胞磷酸化反应可视化技术的开发

基本信息

批准号：
20657039
负责人：
稲垣昌樹
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Aichi Cancer Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、まず、ビメンチンリン酸化抗体可変領域の遺伝子を単離同定し、オープンサンドウィッチイライザ実験系を確立した。次に、従来のリコンビナント抗体発現法に従って、リン酸化抗体可変領域を哺乳類細胞に発現させてみたが、リン酸化ビメンチンを特異的に認識しなかった。そこで、可変領域をタンパク質発現・精製し、哺乳類細胞に導入することを試みることにした。そのために、抗体のラペル方法とタンパク質細胞導入法を確立した。今後、可変領域変異クローンライブラリーからオープンサンドウィッチイライザ実験系を用いて計測した抗原特異的結合性をもとに、細胞内導入時に機能する可変領域配列を決定する予定である。また、リン酸化反応を可視化するための方法として、嫌気性細菌由来蛍光蛋白質を用いた蛋白質相互作用検出法であるプロテイン・コンプレメンテーション解析法を計画している。まず、この嫌気性細菌由来蛍光蛋白質を哺乳類細胞で発現させた。細胞株によっては、この嫌気性細菌由来蛍光蛋白質を発現させると、細胞のダメージが大きく、発現量が非常に少なかった。しかし、汎用性の高い2細胞株について、細胞のダメージは認められず、強い蛍光が観察された。現在、従来法のプロテイン・コンプレメンテーション解析法に用いている蛍光蛋白質切断箇所と比較して予想される切断場所で、本研究に用いている嫌気性細菌由来蛍光蛋白質を分断し、この解析法に用いることが可能か、試している。

在这项研究中，我们首先分离并确定了波形蛋白磷酸化抗体可变区域中的基因，并建立了一个开放的三明治Eliza实验系统。接下来，根据常规的重组抗体表达方法，在哺乳动物细胞中表达了磷酸化的抗体可变区域，但未明确识别磷酸化的波形蛋白。因此，我们决定尝试表达和净化可变区域并将其引入哺乳动物细胞。为此，我们已经建立了一种用于抗体和蛋白质细胞转移方法的翻领方法。将来，我们计划确定基于可变区域突变体克隆文库中开放式三明治Elizer实验系统测量的基于抗原特异性结合的细胞内引入的可变区域序列。此外，作为可视化磷酸化反应的一种方法，我们正在计划一种蛋白质络合分析方法，该方法是一种使用源自厌氧菌的荧光蛋白来检测蛋白质相互作用的方法。首先，这种厌氧细菌衍生的荧光蛋白在哺乳动物细胞中表达。在某些细胞系中，表达这种厌氧细菌衍生的荧光蛋白会对细胞造成巨大损害，而表达水平很少。但是，对于两种高度用途的细胞系未观察到细胞损伤，并且观察到强烈的荧光。目前，我们正在尝试查看该研究中使用的厌氧细菌的荧光蛋白是否可以在裂解位点进行分配，该裂解位点与常规蛋白质络合分析方法中使用的荧光蛋白裂解位点相比，该荧光蛋白是否可以在这种分析方法中使用。