EF2ジフタミド残量の生合成と生理機能に関する分子遺伝学的研究

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ジフテリア毒素(DT)やシュウドモナス・エルギノーサ外毒素A(PA)は、タンパク質合成のペプチド鎖伸長因子2(EF2)分子のADP-リボシル化ドメインに存在するヒスチジン残基の誘導体であるジフタミド残基をNAD存在下でADP-リボシル化することによりEF2を不活化し、タンパク質合成の阻害をもたらして細胞を死に至らしめる。ジフタミド残基は今のところEF2でのみその存在が確認されている。EF2のジフタミド残基とその近傍のいわゆるADP-リボシル化ドメインのアミノ酸配列は、細胞性粘菌からヒトに至る全ての真核生物と、真核生物型のタンパク質合成系を有することが知られている古細菌においてよく保存されており、この領域はEF2機能の発現・調節において生理的に重要な働きを荷負っているものと推定される。リボソームで合成されたEF2前駆体は、ヒチジン残基がたぶん細胞質で修飾を受けて最終的にジフタミド残基を持つ成熟型EF2分子に変換されるものと考えられる。しかしながら、EF2機能の発現・調節におけるジフタミド残基の働きやジフタミドの生合成はほとんど解明されていない。EF2のジフタミド残基の生理機能と生合成を酵母で分子遺伝学的に解明することを目指して、我々はこれまでにジフテリア毒素A断片(DTA)の誘導発現系を酵母で構築し、その系を利用して優性と劣性の毒素耐性突然変異体を分離し、劣性変異体はさらに4つの相補性群に分れることを明らかにしている。本研究ではEF2遺伝子の発現を連続自動測定する目的で、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子のluxAB融合遺伝子を遺伝子発現のリアルタイムレポーターに用いることを検討した。我々は既にバクテリアルフェラーゼ遺伝子が原核生物である藍色細菌では生物時計のリアルタイムモニタリングのための非常に優れたレポーターとなりうることを明らかにしている(記載分献)。酵母のGAL1-10プロモータの下流にluxAB融合遺伝子を連結し、酵母に遺伝子移入した。細胞をガラクトース存在下で培養し、GAL1-10プロモータを活性化することにより、luxAB融合遺伝子が発現して融合ルシフェラーゼが合成され、発光基質n-decanalの存在下で生物発光が観察される筈である。n-decanal飽和条件下でフォトマルで生物発光を測定したところ顕著な発光が観察された。しかしながら、n-decanalを制限したリアルタイムモニタリングの条件下でのCCDカメラによる測定では発光レベルは藍色細菌のレベルの千分の1以下であった。この発光強度ではリアルタイムモニタリングの目的には全く使えなかった。現在、発光強度を改善するために、考えられる種々の原因を検討し、luxAB融合遺伝子の改変を試みている。