好熱性藍色細菌のDNAマイクロアレイの開発と生物時計研究への応用

嗜热蓝藻DNA微阵列的研制及其在生物钟研究中的应用

基本信息

批准号：
15013223
负责人：
石浦正寛
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15013223/
关键词：
DNAマイクロアレイオリゴDNA 好熱性藍色細菌生物時計

项目摘要

これまでに我々は、ゲルろ過精製した45merの非修飾オリゴDNAが性能、コストの両面から適当であることを明らかにした。そのようなオリゴDNAを用いて、クラミドモナスの核、葉緑体、ミトコンドリアの計231遺伝子を搭載したマイクロアレイを作製し、その性能を詳細に検討した。同一のRNAからCy3とCy5で標識されたcDNAを合成し3回のハイブリダイゼーション実験を行い、合計6点分のCy3/Cy5値の平均値を求めた。この値はすべてのスポットにおいて0.5以上2以下の範囲に収まった。これよりアレイ間での再現性は高いことが明らかになった。次に、アレイで有意な発現変化が検出された20遺伝子についてノザンブロットを行い、定量性の高さを検証した。アレイとノザン間での発現変化の定量値の相関係数は0.345であり、約4割の遺伝子でアレイの結果が定性的にノザンのものと一致した。さらに、Cy5で標識されたランダムな配列を持つオリゴDNAの混合液を用いてハイブリダイゼーションを行い、全スポットの検出感度を推定した。その結果オリゴDNAのT含量と検出感度には負の相関があることを見出した。この結果を踏まえて、アレイ用オリゴDNAの選別条件を以下のように設定した。(1)ゲノムの他の遺伝子に対して70%以上の相向性を示さない、(2)GC含量が35〜55%、(3)Tを22%以上含まない、(4)分子内で安定な2次構造をとらない(自由エネルギーが-10.5kcal/mol以上)、(5)繰り返し配列を含まない。好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusの全遺伝子についてオリゴDNAの検索を行ったところ、約9割について上記5つ全ての条件を満たすものが見つかった。残りの1割の遺伝子については、できるだけ基準に近い値を示すオリゴを採用した。これらのオリゴDNAをもちいて、T.elongatusのほぼ全遺伝子を含むオリゴアレイを作製した。RNAサンプルから蛍光標識cDNAを合成してハイブリダイゼーションを行った結果、十分な強度のシグナルが得られた。また、ハイブリダイゼーションの、特異性も確認することができた。

到目前为止，我们已经透露，凝胶过滤的45mer未修饰的寡核DNA适用于性能和成本。使用这样的寡头，我们创建了一个携带231个基因的微阵列，包括核，叶绿体和衣原体线粒体，并详细研究了这些基因的性能。从相同的RNA合成了用CY3和CY5标记的cDNA，并进行了三次杂交实验，以确定总共六个点的平均CY3/CY5值。该值在0.5或更多的范围内，所有位置为2。这表明阵列之间的可重复性很高。接下来，在阵列中检测到的20个具有显着表达变化的基因受到北印迹，以验证高定量性。阵列和北部表达变化的定量值的相关系数为0.345，对于约40％的基因，阵列的结果与北部的阵列在质量上是一致的。此外，使用与Cy5标记的随机序列的寡核DNA的混合物进行杂交，并估计所有斑点的检测灵敏度。结果，发现寡素的t含量与检测灵敏度之间存在负相关。基于这些结果，将阵列寡核DNA的选择条件设置为如下。（1）相对于基因组中的其他基因，它没有显示出70％或以上的相位方向，（2）它的GC含量为35-55％，（3）不包含t的22％以上的t，（4）不接受分子内稳定的二级结构（自由能（自由能）（自由能为-10.5 kcal/mol或更多），并且不包含（5）的序列，并且重复序列。当寻找嗜热蓝细菌的所有基因的寡素基因热，大约90％的基因符合上述所有五个条件。对于其余10％的基因，使用了尽可能接近标准值的寡核体。使用这些寡头，制备了几乎所有含有T. elongatus基因的所有基因的寡素体。从RNA样品中合成荧光标记的cDNA，并进行杂交，从而产生足够强度的信号。此外，可以确认杂交的特异性。