好熱性藍色細菌のDNAマイクロアレイの開発と生物時計研究への応用

嗜热蓝藻DNA微阵列的研制及其在生物钟研究中的应用

• 批准号: 15013223
• 负责人: 石浦 正寛
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15013223/
• 关键词: DNAマイクロアレイ; オリゴDNA; 好熱性藍色細菌; 生物時計

これまでに我々は、ゲルろ過精製した45merの非修飾オリゴDNAが性能、コストの両面から適当であることを明らかにした。そのようなオリゴDNAを用いて、クラミドモナスの核、葉緑体、ミトコンドリアの計231遺伝子を搭載したマイクロアレイを作製し、その性能を詳細に検討した。同一のRNAからCy3とCy5で標識されたcDNAを合成し3回のハイブリダイゼーション実験を行い、合計6点分のCy3/Cy5値の平均値を求めた。この値はすべてのスポットにおいて0.5以上2以下の範囲に収まった。これよりアレイ間での再現性は高いことが明らかになった。次に、アレイで有意な発現変化が検出された20遺伝子についてノザンブロットを行い、定量性の高さを検証した。アレイとノザン間での発現変化の定量値の相関係数は0.345であり、約4割の遺伝子でアレイの結果が定性的にノザンのものと一致した。さらに、Cy5で標識されたランダムな配列を持つオリゴDNAの混合液を用いてハイブリダイゼーションを行い、全スポットの検出感度を推定した。その結果オリゴDNAのT含量と検出感度には負の相関があることを見出した。この結果を踏まえて、アレイ用オリゴDNAの選別条件を以下のように設定した。(1)ゲノムの他の遺伝子に対して70%以上の相向性を示さない、(2)GC含量が35〜55%、(3)Tを22%以上含まない、(4)分子内で安定な2次構造をとらない(自由エネルギーが-10.5kcal/mol以上)、(5)繰り返し配列を含まない。好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusの全遺伝子についてオリゴDNAの検索を行ったところ、約9割について上記5つ全ての条件を満たすものが見つかった。残りの1割の遺伝子については、できるだけ基準に近い値を示すオリゴを採用した。これらのオリゴDNAをもちいて、T.elongatusのほぼ全遺伝子を含むオリゴアレイを作製した。RNAサンプルから蛍光標識cDNAを合成してハイブリダイゼーションを行った結果、十分な強度のシグナルが得られた。また、ハイブリダイゼーションの、特異性も確認することができた。

This is the first time I've ever had a problem with DNA. The nuclear, chloroplast, and nuclear components of the DNA sequence are discussed in detail. The average value of Cy3/Cy5 for the same RNA sequence was calculated for 3 cycles and 6 minutes. The value of this parameter is greater than 0.5 and less than 2. The reproducibility of the film is high. In addition, the detection of intentional changes in the detection of 20 genes is carried out in the middle of the detection process, and quantitative changes are carried out. The correlation coefficient of quantitative value of the occurrence of the disease between the two groups is 0.345, about 4, and the result of qualitative analysis is consistent. In addition, Cy5 can be identified as a mixture of DNA, and the sensitivity of the DNA mixture can be estimated. The results show that the T content of DNA is negatively correlated with the T content of DNA. The following conditions are set for DNA selection: (1)(2)GC content of 35 ~ 55%,(3)T content of 22% or more,(4) intramolecular stability of secondary structure (free energy content of-10.5kcal/mol or more),(5) equilibrium alignment of secondary structure. The thermophilic blue bacterium Thermosynechococcus elongatus has a complete DNA sequence, about 9 times the DNA sequence, 5 times the DNA sequence. The first part of the book is about how to use the book. The DNA of T. elongatus was cut off and the DNA of T.elongatus was cut off The RNA sequence was identified by DNA sequencing. The difference between the two is that

项目成果

Burder R.et al.: "Identification of a new cryptochrome class : structure, function and evolution"Mol.Cell. 11. 59-67 (2003)

Burder R.等人：“新隐花色素类的鉴定：结构、功能和进化”Mol.Cell。

Hayashi F.et al.: "Stoichiometric interactions between cyanobacterial clock proteins KaiA and KaiC and enhancement of KaiC phosphorylation"Biochem.Biophy.Res.Comm.. 361. 195-202 (2004)

Hayashi F.等人：“蓝藻时钟蛋白 KaiA 和 KaiC 之间的化学计量相互作用以及 KaiC 磷酸化的增强”Biochem.Biophy.Res.Comm.. 361. 195-202 (2004)

Hayashi F.et al.: "ATP-induced hexameric ring structure of the cyanobacterial circadian clock protein KaiC"Genes to Cells. 8. 287-296 (2004)

Hayashi F.等人：“蓝藻生物钟蛋白 KaiC 的 ATP 诱导六聚环结构”基因到细胞。

Iwase R.et al.: "Crystalization and preliminary crystallographic analysis of the circadian clock protein KaiB from the thermophillic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1"Acta.Crysta.. (印刷中). (2004)

Iwase R. 等人：“来自嗜热蓝细菌Thermosynechoccas elongatus BP-1 的生物钟蛋白KaiB 的结晶和初步晶体学分析”Acta.Crysta..（出版中）。

Onai K.et al.: "Natural transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1 : a simple and efficient method for gene transfer"Mol.Genet.Genomics. 271. 50-59 (2004)

Onai K.等人：“嗜热蓝细菌Thermosynechocococcus elongatus BP-1的自然转化：一种简单而有效的基因转移方法”Mol.Genet.Genomics。