好熱性藍色細菌のDNAマイクロアレイの開発と生物時計研究への応用

嗜热蓝藻DNA微阵列的研制及其在生物钟研究中的应用

• 批准号: 14014215
• 负责人: 石浦 正寛
• 金额: $ 4.48万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014215/
• 关键词: DNAマイクロアレイ; オリゴDNA; 好熱性; 藍色細菌; 生物時計

現在流通している最も典型的なDNAマイクロアレイは、PCR産物をスポットしたタイプである。しかしこのタイプのアレイはi)作製に多大な労力を必要とする、ii)高額である、iii)相同遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションの危険性がある、という大きな問題を有している。これらの問題を解決するため、本研究ではオリゴDNAを用いた新規なマイクロアレイの開発を行った。これまで我々はオリゴDNAの精製法と鎖長を至適化することにより大幅なコスト削減に成功している。また、標的以外の遺伝子に70%以上の相同性を示さなければクロスハイブリダイゼーションは起こらないことを実験的に明らかにした。今年度は以上の結果を踏まえて、ゲノム上の全遺伝子について全自動でアレイに最適なオリゴDNAを検索するソフトウェアを開発した。オリゴDNAの選別条件は、i)ゲノムの他の遺伝子に対して70%以上の相同性を示さない、ii)GC含量が35〜55%、iii)A含量が35%以下、iv)分子内で安定な2次構造をとらない(ΔG>-12 kcal/mol)、v)分子間でダイマーを形成しない、の5点とした。i)の条件については、MegaBlastとSmith-Watermanアルゴリズムを併用することにより相同配列を超高感度で比較的高速に検出することが可能である。このソフトウェアを用いて、緑藻クラミドモナスの葉緑体とミトコンドリアゲノムの全遺伝子及び97種の核遺伝子に対して最適オリゴの検索を行った。これらの遺伝子群は大きなGC含量の偏りを示すにも関わらず、約9割の遺伝子について全条件を満たすオリゴが検索できた。さらに検索したオリゴDNAを用いて実際にマイクロアレイを作製し、その性能を検討した。その結果、既存のPCR型クラミドモナスアレイの20分の1のRNA量で十分な強度のシグナルが得られ、高感度であることが示された。また、全く同じRNAを用いてCy3とCy5標識cDNAを合成し、ハイブリダイゼーションを行った結果、総スポットの約95%においてCy5/Cy3のシグナル比が2倍〜1/2倍の範囲内に収まった。このことから定量データの正確性も非常に高いことが示された。

The most typical DNA samples in circulation today are DNA maikokoroaiya and PCR products. i) how much effort is needed to control the situation, ii) how high the cost is, iii) how dangerous the situation is between the same child and the same child. This study is aimed at solving the problem of DNA fragmentation. The DNA purification method was successful in greatly reducing the length of DNA. More than 70% of the identity of the target is shown in the table below. This year's results show that the full range of DNA detection tools on the system is fully automated and the most suitable DNA detection tools are available. The selection conditions for DNA include: i) more than 70% identity between the two genes, ii)GC content of 35 - 55%, iii)A content of 35% or less, iv) intramolecular stability of secondary structure (ΔG>-12 kcal/mol), v) intermolecular formation of DNA, and 5 points. i) The conditions include: MegaBlast, Smith-Waterman, etc., the same configuration, ultra-high sensitivity, and relatively high speed detection. The chloroplasts of these species are isolated from the whole genome and 97 species of nuclear DNA are isolated from the genome. The content of GC in the sample is about 9%, and the total content of GC in the sample is about 9%. In addition, the performance of the system is also discussed. The results showed that the existing PCR type was very sensitive and the RNA content was very high. Cy3 and Cy5 were used to identify cDNA for synthesis of complete RNA. The results showed that about 95% of the total RNA was Cy 5/Cy3, and the ratio of Cy5/Cy3 was 2 to 1/2 times. The legitimacy of the quantitative analysis is very high.

项目成果

Brudler R. et al.: "Identification of a new cryptochrome class : structure, function, and evolution"Mol.Cell. 11. 59-67 (2003)

Brudler R. 等人：“新隐花色素类的鉴定：结构、功能和进化”Mol.Cell。

Hayashi F. et al.: "ATP-induced hexamer formation and structure of the cyanobacterial circadian clock protein KaiC"Genes to Cells. (in press). (2003)

Hayashi F. 等人：“ATP 诱导的六聚体形成和蓝藻生物钟蛋白 KaiC 的结构”基因到细胞。