生物時計装置の原子レベルでの解明

从原子水平阐明生物钟系统

基本信息

批准号：
15657047
负责人：
石浦正寛
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

藍色細菌の生物時計遺伝子kaiA、kaiB、kaiCを世界で初めて同定して以来、我々は藍色細菌の生物時計の研究において世界の最先端に位置している。制御タンパク質の一種である時計タンパク質は、藍色細菌由来のものを含めて一般に安定な形で大量調製することが困難なため、時計タンパク質の構造と機能の研究はほとんど手つかずである。我々はX線結晶構造解析により時計タンパク質の立体構造を解明し、時計の分子機構(24時間周期の自律的な発振機構)を原子レベルで明らがにしたいと考えている。分解能1.8ÅでKaiAのC末端時計発振ドメイン(KaiA_<174-283>)の構造解析に成功した。サブユニット構造は新規フォールドであった。機能単位である二量体構造はユニークであり、凹レンズ型構造であった。In Vitro生化学解析、in vivoリズム発現解析により時計発振に重要な残基HiS270を同定した。KaiBに関して、64位のThr残基をCysに置換した変異タンパク質を調製し、共結晶化法でKaiB水銀原子置換結晶を調製し、分解能2.6Åの構造解析に成功した。サブユニット構造は新規フォールドであった。機能構造は四量体であり、非対称構造を持つ極めてユニークな菱形板状構造であった。四量体構造の表面静電ポテンシャルより、概日リズム発振に重要な特徴的な領域(1)Negative ridgeと(2)Positive cleftを見いだした。六量体型KaiCの結晶構造解析のため、新たに変異タンパク質の結晶化を目指した。変異タンパク質の精製法を確立し、結晶化に成功した。しかし、極めて薄い板状晶であるため、X線照射には不適切であった。現在、結晶化条件を検討し、X線照射に適した結晶の調製を目指している。

自从世界上首次识别生物钟基因kaia，kaib和kaic以来，我们一直在蓝细菌的生物钟研究中处于世界的最前沿。观察蛋白是一种调节蛋白，通常很难以稳定的形式大量制备，包括从蓝细菌衍生出的蛋白质，因此几乎没有触摸对手表蛋白的结构和功能的研究。我们想通过X射线晶体结构分析阐明手表蛋白的三维结构，并阐明原子水平上时钟的分子机制（在24小时内的自动振荡机制）。我们成功地分析了KAIA的C端时钟振荡域（KAIA_ <174-283>）的结构，分辨率为1.8Å。亚基结构是一种新颖的折叠。功能单元二聚体结构是唯一的，具有凹形镜头形结构。体外生化分析和体内节律表达分析确定了HIS270的残基，这对于时钟振荡很重要。关于KAIB，制备了一种静音蛋白，其中将位置64处的THR残基替换为CYS，并通过共结晶制备KAIB汞原子叠取代的晶体，并且成功的分辨率为2.6Å的结构分析是成功的。亚基结构是一种新颖的折叠。功能结构是四聚体，它是具有不对称结构的极其独特的钻石形板状结构。从四聚体结构的表面静电电位，我们发现了独特的区域（1）和（2）正对昼夜节律振荡很重要。为了分析六聚体KAIC的晶体结构，我们旨在结晶突变蛋白。建立了一种纯化突变蛋白的方法并成功结晶。但是，由于它是一种非常薄的板状晶体，因此不适合X射线照射。当前，我们正在考虑结晶条件，并旨在制备适合X射线照射的晶体。