VIII型コラーゲン発現調節因子の分子生物学的研究

研究計画に従って培養角膜内皮細胞からmRNAを抽出しその中にVIII型コラーゲンalpha2鎖のメッセージが豊富に存在することを確かめた。そのmRNAを用いてプライマー伸展法によりVIII型コラーゲンalpha2鎖をコードするcDNAを5'端まで伸展させた。このcDNAをプローブとして用いてマウス遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。その結果2つの陽性クローンが得られそれぞれをプラスミドベクターにサブクローニングした。それぞれのクローンの詳細な制限酵素地図を描きエクソンの位置を決定したところひとつのクローンには以前報告した約2kbある大きいエクソンとそこから300bp上流に196bpからなるエクソンが存在した。それに対してもうひとつのクローンにはcDNAの5'端のシークエンスを含む約160bpのエクソンが存在し一番目のエクソンと考えられた。そのエクソンの上流域約2kbについてVIII型コラーゲンalpha2鎖遺伝子のプロモーター活性を検討している。まず転写開始部位近傍のシークエンスを行った結果数個のSP1結合部位が見られたがCATボックスおよびTATAボックスは見られなかった。次にその上流域2kbの遺伝子断片をCATベクターに挿入したCATコンストラクトを作製し上流から約500bpずつ削減した3種の削減型コンストラクトを得た。現在これらを培養角膜内皮細胞にトランスフェクトしそれぞれのCATアクティビティーを測定している。さらにこの2kbの遺伝子断片をbetaガラクトシダーゼ遺伝子に接続し、それをマウスに導入して胎児マウスでのVIII型コラーゲンalpha2鎖の発現を検討中である。

研究計画に従って培養角膜内皮細胞からmRNAを抽出しその中にVIII型コラーゲンalpha2鎖のメッセージが豊富に存在することを確かめた。そのmRNAを用いてプライマー伸展法によりVIII型コラーゲンalpha2鎖をコードするcDNAを5'端まで伸展させた。このcDNAをプローブとして用いてマウス遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。その結果2つの陽性クローンが得られそれぞれをプラスミドベクターにサブクローニングした。それぞれのクローンの詳細な制限酵素地図を描きエクソンの位置を決定したところひとつのクローンには以前報告した約2kbある大きいエクソンとそこから300bp上流に196bpからなるエクソンが存在した。それに対してもうひとつのクローンにはcDNAの5'端のシークエンスを含む約160bpのエクソンが存在し一番目のエクソンと考えられた。そのエクソンの上流域約2kbについてVIII型コラーゲンalpha2鎖遺伝子のプロモーター活性を検討している。まず転写開始部位近傍のシークエンスを行った結果数個のSP1結合部位が見られたがCATボックスおよびTATAボックスは見られなかった。次にその上流域2kbの遺伝子断片をCATベクターに挿入したCATコンストラクトを作製し上流から約500bpずつ削減した3種の削減型コンストラクトを得た。現在これらを培養角膜内皮細胞にトランスフェクトしそれぞれのCATアクティビティーを測定している。さらにこの2kbの遺伝子断片をbetaガラクトシダーゼ遺伝子に接続し、それをマウスに導入して胎児マウスでのVIII型コラーゲンalpha2鎖の発現を検討中である。