ES細胞を用いたVIII型コラーゲンα1鎖遺伝子の相同組換え

本研究の目的は角膜内皮細胞が主に産生するVIII型コラーゲンのうちのα1鎖をコードする遺伝子をES細胞(胚性幹細胞)を用いてターゲッティングを行なうことであった。ターゲッティングベクターの作製にはすでにクローニングされていたマウスVIII型コラーゲンα1鎖遺伝子を用いた。その遺伝子からポリアデニレーション部を除きpBluescriptに挿入した。次にエクソンのユニークな部位にポリアデニレーション部を欠いたネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ後、遺伝子の5'未端にチミジンキナーゼ遺伝子を入れターゲッティングベクターを完成させた。このベクターDNAをエレクトロポレーション法によりES細胞にトランスフェクトした後、ES細胞をG418およびGANCを含むメディウムで2週間培養した。形成されたES細胞のコロニーからDNAを抽出し、HindIIIで切った後ターゲッティングベクター外の遺伝子断片をプローブとしてサザーンブロッティングを行った。その結果250個のコロニーから抽出したDNAのうち3個にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されることにより生ずるバンドが内因性のバンドより大きい部位に認められた。この研究の最終目的はVIII型コラーゲンα1鎖欠損マウスを作製し、その遺伝子および分子の機能を解明することであるため今回得られた陽性クローンはマイクロインジェクション法によりマウスの胞胚内に植え込みキメラマウスを作製し、そのキメラマウスをかけあわせることによりターゲッティングされたVIII型コラーゲンα1鎖遺伝子を胚細胞に移行させることが今後の課題である。

本研究の目的は角膜内皮細胞が主に産生するVIII型コラーゲンのうちのα1鎖をコードする遺伝子をES細胞(胚性幹細胞)を用いてターゲッティングを行なうことであった。ターゲッティングベクターの作製にはすでにクローニングされていたマウスVIII型コラーゲンα1鎖遺伝子を用いた。その遺伝子からポリアデニレーション部を除きpBluescriptに挿入した。次にエクソンのユニークな部位にポリアデニレーション部を欠いたネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ後、遺伝子の5'未端にチミジンキナーゼ遺伝子を入れターゲッティングベクターを完成させた。このベクターDNAをエレクトロポレーション法によりES細胞にトランスフェクトした後、ES細胞をG418およびGANCを含むメディウムで2週間培養した。形成されたES細胞のコロニーからDNAを抽出し、HindIIIで切った後ターゲッティングベクター外の遺伝子断片をプローブとしてサザーンブロッティングを行った。その結果250個のコロニーから抽出したDNAのうち3個にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されることにより生ずるバンドが内因性のバンドより大きい部位に認められた。この研究の最終目的はVIII型コラーゲンα1鎖欠損マウスを作製し、その遺伝子および分子の機能を解明することであるため今回得られた陽性クローンはマイクロインジェクション法によりマウスの胞胚内に植え込みキメラマウスを作製し、そのキメラマウスをかけあわせることによりターゲッティングされたVIII型コラーゲンα1鎖遺伝子を胚細胞に移行させることが今後の課題である。