メラニン生合成に及ぼす鍵酵素チロシナーゼの構造と機能の解析

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まず、メラニン生合成の鍵酵素チロシナーゼタンパク質の予想される活性部位や、疎水性・親水性の解析等を、パーソナルコンピューターを用いて系統的に解析した。この結果をもとに、改変する部位を決め、それに対応する塩基配列に変異を導入することにした。最初に、ウズラ及びスッポンのチロシナーゼcDNAのクローニングを試みた。網膜色素上皮から調製したRNAを材料にして、一部解明していたゲノムDNAの塩基配列をもとにプライマーを合成し、RTPCR法によってこれらをクローニングすることに成功した。これまでに当研究室でクローニングしていたマウスチロシナーゼcDNAに加え、ヒト、カエル、ニワトリのcDNAから予想されたアミノ酸配列を比較した。その結果、これら6種の予想されたチロシナーゼタンパク質には、それぞれ幾つかのN-グリコシレイションされうる部位が存在するものの、そのうちの4カ所がよく保存されていることがわかった。この結果はハムスターメラノーマチロシナーゼの報告(サイトは報告されていない)と一致した。したがって、この4カ所が、実際にN-グリコシレイションされている可能性が高いものと思われる。また、酵素活性を発現するために重要である銅イオンを結合すると予想されているサイトもよく保存されていた。さらにシステインのクラスターも、17(多くて)のうち16が同一のサイトにあった。N末端近傍と、C末端近くには疎水性の高い領域があり、特にC末端近くの部位は、トランスメンブレン領域であろうと思われる。これらの保存された領域に対応するマウスのcDNAに変異を導入すべく作業中である。またホストになるべき色素細胞については、メラニン産生の安定性に着目して、細胞のクローニングを進めている。