アルツハイマー病脳における老人斑形成機序に関する研究

阿尔茨海默病脑内老年斑形成机制研究

基本信息

批准号：
05680675
负责人：
播口之朗
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至 1995
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05680675/
关键词：
アルツハイマー病老人斑アミロイド APP ibotenic acid カテプシンD クラスリン GFAP ubiquitin MAPIa

项目摘要

アルツハイマー病(AD)脳の老人斑に沈着するアミロイド線維の構成蛋白はアミロイドβ蛋白前駆体(APP)から切り出される38-43アミノ残基のアミロイドβ蛋白(Aβ)である。APPは1回膜貫通型の受容体蛋白としての構造を有しており、その機能を考える場合に細胞内に位置するC末端側部分の動態を明らかにすることが重要である。本研究では、このような知見に基づきAD脳におけるAPPのC端部分の分布について検討することが老人斑形成機序に寄与すると考えた。APP分子C末端断片の動態を検討するために、Multiple Antigen Peptide(MAP)構造をもつAPP分子のC末端アミノ酸14残基合成ペプチド(APP 682-695,YENPTYKFFEQMQN)に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を作製した。これらの抗体を用いてAD脳の海馬を含む側頭葉領域での免疫組織化学的検索を行った。抗血清R2Bでは皮質の神経細胞及びその周辺に多数の顆粒状蓄積物、血管壁周囲を陽性に染色した。一方、モノクローナル抗体6H・12では海馬周辺を中心に典型的な老人斑とは異なる斑状の細胞外構造物が認められた。この構造物は健常者脳では殆ど認められず、ADに特徴的と考えられた。また、R2Bの認識する構造物とは形態、出現頻度、部位ともに異なっていた。AD脳連続切片を用いた検討では、このAPP分子C末端14残基配列に対するモノクローナル抗体で染色された異常構造物は抗Aβ抗体では染色されなかった。AD脳皮質ホモジネートの各抗体を用いたウエスタンブロットによる検討において、6H12は23、29、30KDaのバンドを染色し、6H12の染色する構造物の成分としてAβを含んだAPPのC端部分断片が存在する可能性が示唆された。APP分子C末端14残基配列はin vitroにおいてフィラメント様構造物及びアモルファス構造物を形成したが、その構造物の免疫電顕の結果、R2Bは直径7-10nmのフィラメント様構造物と結合したが、6H12はフィラメント様構造物ではなく、むしろアモルファスな構造物を強く認識した。これは6H12とR2Bの認識するコンフォメーションが異なることを示しており免疫組織化学の結果と一致した。本研究によりAD脳内で特殊なコンフォメーションをもつAPPのC端部分が細胞外で斑状に集積し、その構造物にはAPPのAβ部分が含まれている可能性があることが示唆された。老人斑形成においてAPPのC端部分の関与については報告は少ないが本研究で明らかにされた集積物が老人斑形成の中間体である可能性も考えられ今後その点について検討を加えていく予定である。

沉积在老年鼠（AD）大脑中的老年斑块中的淀粉样纤维的组成蛋白是淀粉样蛋白β蛋白（Aβ），氨基残基38-43从淀粉样蛋白β蛋白前体（APP）中切除38-43。 APP具有单个跨膜受体蛋白的结构，并且在考虑其功能时，重要的是要阐明位于细胞内的C末端部分的动力学。在这项研究中，我们认为，根据这些发现，考虑APP在AD大脑中的C端部分的分布将有助于老年斑块形成的机理。为了研究APP分子的C末端片段的动力学，制备了针对C末端氨基酸14-沉降合成肽（APP 682-695，YenptykffeqMQN）的App Molecule，具有多抗抗原ppty（Map Map Peptide）结构。这些抗体用于在颞叶区域进行免疫组织化学搜索，包括广告大脑的海马。抗血清R2B在皮质神经细胞内外的血管壁的大量颗粒状积累和周围染色。另一方面，单克隆抗体6H-112显示出片状的细胞外结构，这些结构与典型的老年斑块不同，主要是海马周围。在健康的大脑中几乎看不到这种结构，被认为是AD的特征。此外，R2B识别的结构在形态，发生频率和位置方面都不同。在使用AD脑串行切片的研究中，用抗Aβ抗体染色，用针对该APP分子的C末端14残基序列染色的异常结构。在使用AD皮质匀浆的各自抗体的蛋白质印迹中，6H12的染色带为23、29和30 kDa，这表明含有Aβ作为6H12染色结构的成分的APP的C端片段。在App分子上的C末端14残基序列在体外形成丝状和无定形结构，并且该结构的免疫电子显微镜表明，R2B与直径为7-10 nm的丝状结构结合，而6H12的结构是6H12，而6H12强烈识别的无晶体结构，而不是材料样结构。这表明6H12和R2B的公认构象与免疫组织化学结果一致。这项研究表明，具有特殊构象的APP的C端部分会在细胞外积累在AD大脑中，并且该结构可能包含APP的Aβ部分。很少有关于APP的C端部分参与老年斑块形成的报道，但是这项研究中揭示的积累可能是老年斑块形成中的中间体，我们计划将来研究这一点。