新しい蛍光ラベル化リガンドを用いたエンドサイトーシス研究とその素過程変異株の分離

使用新荧光标记配体的内吞作用研究和基本过程突变体的分离

• 批准号: 04808044
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04808044/
• 关键词: エンドサイトーシス; 低密度リポタンパク質; リソソーム; エンドソーム; 蛍光共鳴エネルギー移動; 変異株細胞; セルソーター

本研究は、真核細胞のエンドサイトーシス過程における細胞内輸送に関与する細胞側因子(細胞装置)を分子遺伝学的に同定し、その分子機構解明を目的としている。本年度は、エンドサイトーシス素過程の内、特に、後期エンドソームからリソソームへのリガンド(低密度リポタンパン質)の移行過程(リガンドのソーティング)に変異を持つ細胞を簡便、迅速に効率よく分取するため、また、そのようにして得た変異「生」細胞中のLDLの分解を定量的にアッセイするための方法を確立できた。具体的には、低密度リポタンパク質(LDL)内にNBD-リノール酸エステル(NBD-LE)とR18(ローダミン系脂質アナログ)を再構成法により封入し、受容体媒体エンドサイトーシスによりCHO細胞に取り込ませた。この時、エンドソーム内のLDLではNBD-LEとR18に蛍光共鳴エネルギー移動(RET)が生起していて2つの蛍光強度化(NBD/R18)は小さい。しかし、リソソーム内に移行してLDLが分解されると、2つの蛍光色素間の相対的距離が大きくなり、RETが解消し、[NBD/R18]の値が大きくなる。蛍光ラベルしたLDLを取り込ませ、その細胞をNBDとR18の蛍光を同時に蛍光測光可能なセルソータを用いて分析すれば、個々の細胞の蛍光はそれから得られる蛍光強度比[NBD/R18]の値に対応して、2次元モニター上に個々の点としてプロットされる。[NBD/R18]のプロットの分布の仕方で、LDLの後期エンドソームよりリソソームへの移行の程度が定量的に解析できた。[NBD/R18]の値が小さい1つのプロットは、つまり、RETが解消されていない細胞1個に相当するので、これをセルソータにより分取すれば、この条件でのこの輸送過程に変異を持つ変異株を生きたまま分離することが可能である。これとは別にコレステロール生合成阻害剤であるプラバスチンとプロモデオキシウリジンを用いたネガティブ選択法により、LDLの細胞内での分解に異常を持つT41細胞を、CHO-K1細胞を野生株として得ることに成功したが、このT41内のLDLの分解の遅さを上記セルソータを用いた方法で定量的に解析できた。今後は、このような変異株の分取を本方法にて行い、その分子遺伝学研究を進めたい。

In this study, the molecular biology of eukaryotic cell delivery factor (cell device) and eukaryotic cell delivery factor (cell device) are the same, and the molecular mechanism is clear about the purpose of this study. During the course of this year's, special and later periods of the year, during the course of this year, special and later periods, the transfer process (low-density environmental pollution) was significantly higher than that of the current year, especially in the course of this year, especially in the future. The quantitative method for the decomposition of LDL in the cell is established by the method of determining the quantity of DNA in the cell. Specific NBD-, low density, low At the same time, you need to check the LDL

项目成果

村田 昌之: "pH-dependent membrane fusion and vesiculation of phospholipid large unilamellar vesicles induced by amphiphilic anionic and cationic peptide." Biochemistry. 31. 1986-1992 (1992)

Masayuki Murata：“两亲性阴离子和阳离子肽诱导的磷脂大单层囊泡的 pH 依赖性膜融合和囊泡形成。生物化学”31。1986-1992 (1992)

鍵和田 聡: "In vitro fusion of rabbit liver Golgi membranes with liposomes." J.Biol.Chem.268. 1430-1435 (1993)

Satoshi Kagiwada：“兔肝高尔基体膜与脂质体的体外融合。”J.Biol.Chem.268（1993）。

村田 昌之: "エンドサイトーシスと膜融合" 新生化学実験講座. 6. 817-828 (1992)

村田雅之：《内吞作用与膜融合》新生物化学实验教程6。817-828（1992）。

村田 昌之: "Specifity of amphiphilic anionic peptides for fusion of phospholipid vesicles." Biophys.J.(1993)

Masayuki Murata：“两亲性阴离子肽对于磷脂囊泡融合的特异性。Biophys.J.(1993)

村田 昌之: "The interaction between microtubles and the Golgi vesicles isolated from rabbit liver in vitro." Biol.Cell.75. 127-134 (1992)

Masayuki Murata：“体外从兔肝脏中分离出的微管和高尔基体囊泡之间的相互作用。”Biol.Cell.75（1992）。